Rac1 GTPase高度活化在造血干祖细胞恶性转化中的作用研究；A20对急性淋巴细胞白血病细胞生物学功能的影响及机制研究

摘要

第一部分Rac1 GTPase高度活化在造血干祖细胞恶性转化中的作用研究
　　研究目的:正常造血干祖细胞向白血病细胞的恶性转化是由多种因素的改变所引起的，包括基因改变等细胞内在的因素及微环境作用异常等细胞外部的因素。造血干祖细胞与骨髓微环境之间相互作用的改变，与白血病的发生密切相关。Rac1作为造血干细胞归巢的关键调控分子，参与造血细胞与骨髓微环境的相互作用，在多种类型的白血病细胞中存在Racl GTPase的高度活化。本研究通过探索Racl GTPase的高度活化对造血干祖细胞生物学行为及其对骨髓微环境与造血干祖细胞之间相互作用的影响，最终阐明Racl GTPase的高度活化所引起的骨髓微环境和造血干细胞相互作用异常在造血干祖细胞恶性转化及白血病发展和维持中的作用。
　　研究方法:构建表达组成活化型Rac1、AML1-ETO9a(AE9a)单基因及共表达组成活化型Rac1、AML1-ETO9a(AER)双基因的逆转录病毒载体，包装病毒，感染经免疫磁珠富集后的C-kit+小鼠造血干祖细胞。用Weseren blot和Pull down的方法检测蛋白表达水平，通过Transwell方法检测感染后GFP阳性细胞的迁移能力，与Fibronectin的粘附实验检测粘附能力，培养于甲基纤维素中检测集落形成能力，流式细胞术检测G0期比例，qRT-PCR检测微环境相关分子的表达水平。用含AE9a单基因或AER双基因的逆转录病毒感染造血干祖细胞并移植受体鼠，构建小鼠白血病发病模型。流式细胞术检测发病小鼠的免疫表型，瑞氏染色和HE染色观察发病小鼠的病理类型。将AE9a组和AER组发病小鼠的脾脏细胞移植半致死剂量照射后的受体小鼠，流式细胞术检测18h细胞归巢能力，以及不同时间点GFP阳性细胞在骨髓、脾脏中的分布，并观察两组小鼠的生存期。在Rac1抑制剂处理实验中，AER组发病小鼠细胞体外经Rac1抑制剂EHT1864孵育2h后移植照射后受体小鼠，观察归巢能力、白血病细胞随时间变化的分布及生存期。用胶原酶消化新生鼠颅骨的方法获取成骨细胞，用小鼠骨髓细胞体外贴壁培养的方法获取基质细胞，将获取的细胞与AER组小鼠骨髓细胞共培养4d后，检测细胞周期，凋亡，集落形成能力的变化。在体内药物处理实验中，AER组小鼠细胞移植受体鼠后随机分为4组，按如下时间和剂量经过腹腔注射给药:(1) PBS（第5-9天），(2) Ara-C(500 mg/kg·d，第8，9天)，(3) EHT1864(40 mg/kg·d，第5-9天)，(4) Ara-C(500 mg/kg·d，第8，9天)andEHT1864(40 mg/kg·d，第5-9天)，观察小鼠的生存期及不同天数尾血血象及GFP阳性细胞变化。
　　研究结果:成功构建三种逆转录病毒载体，蛋白表达检测显示感染后的骨髓细胞中活化型Rac1 GTPase表达升高，有AE9a的表达。表达组成活化型Rac1的小鼠c-Kit+造血干祖细胞迁移能力增强，粘附能力增强，集落形成能力增强，G0期比例上升，微环境相关分子的表达水平升高，与对照组相比都具有显著差异。成功建立单基因AE9a和双基因AER小鼠发病模型，发病小鼠细胞基因组中有AE9a和活化型Rac1GTPase的整合，二者蛋白水平升高，组织病理检测显示骨髓、脾脏、肝脏瘤细胞浸润，瑞氏染色外周血、骨髓、脾脏中幼稚细胞增多，免疫表型显示为急性髓系白血病。与AE9a组发病小鼠细胞相比，AER组发病小鼠细胞二次移植受体鼠后的生存期缩短，移植后不同天数GFP阳性细胞在外周血和骨髓的比例增多，细胞归巢能力增强，与归巢相关的分子表达水平升高，两组之间的差异具有统计学意义。在Rac1抑制剂处理实验中，AER组发病小鼠细胞体外经EHT1864孵育2h后移植小鼠，生存期较对照组显著延长，移植后不同天数GFP阳性细胞在骨髓和脾脏的比例降低，处理后的细胞归巢能力显著降低，与归巢相关的分子表达水平降低。AER组发病小鼠骨髓细胞分别与骨髓基质细胞及成骨细胞共培养，共培养组骨髓细胞的G0期比例显著增多。与成骨细胞共培养后的骨髓细胞凋亡水平降低，集落形成能力增强。与MSC共培养后，可以使更多的白血病细胞处于静息状态。在体内药物处理实验中，相比对照组，EHT1864组小鼠在不同天数，外周血GFP阳性率及白细胞数目无显著差异。而相比Ara-C组，两种药物联合组小鼠在不同天数外周血GFP阳性率及白细胞数目均显著降低，小鼠生存期显著延长。
　　研究结论:Rac1 GTPase的高度活化能够增强造血干祖细胞的迁移、粘附能力，促进造血干祖细胞的集落形成能力和静息水平，这些生物学行为的变化促进造血干祖细胞与骨髓微环境之间的相互作用。Rac1 GTPase的高度活化通过促进白血病细胞归巢到骨髓微环境并改变与微环境的相互作用，从而促进白血病细胞维持静息和抵抗凋亡的能力，进而加速白血病的发病进程。通过靶向Rac1 GTPase高度活化的抑制剂EHT1864联合化疗药物可以有效延长发病小鼠的生存期。
　　第二部分A20对急性淋巴细胞白血病细胞生物学功能的影响及机制研究
　　研究目的:A20亦称为TNF-α诱导的蛋白3(TNFAIP3)，是调节细胞生存的重要分子，在多种恶性肿瘤的发生中有重要作用。A20在多种肿瘤如乳腺癌、肾透明细胞癌、结直肠癌等中都存在异常的过表达。虽然A20在淋巴瘤中抑癌基因的作用已被证实，但是目前关于A20在急性淋巴细胞白血病(ALL)发生发展中的生物学功能尚不明确。本研究通过检测A20在ALL细胞中的表达及下调A20表达以探索A20蛋白在ALL中的生物学功能及相关分子机制。
　　研究方法:用WB检测ALL病人标本及几种ALL细胞系中A20的表达。构建含有A20-shRNA的慢病毒载体，感染ALL细胞系Jurkat细胞、Nalm-6细胞和Reh细胞，用qRT-PCR和WB检测A20干扰效果。MTT的方法检测感染后的细胞增殖能力及对化疗药的IC50，用PI标记检测周期变化，用AnnexinⅤ联合PI的方法检测细胞凋亡水平及对化疗药物的敏感性。裸鼠成瘤实验检测细胞的体内增殖能力。WB检测细胞增殖、周期、凋亡等相关信号分子的表达变化。
　　研究结果:相对正常供者，在ALL病人骨髓单个核细胞及ALL细胞系中A20蛋白表达水显著增加。成功构建含有A20-shRNA的慢病毒载体，并且经过qRT-PCR和WB实验证实干扰效果明显;功能实验显示，相比对照组，在Jurkat细胞、Nalm-6细胞和Reh细胞中下调A20表达后，细胞增殖减慢，增殖相关信号分子ERK磷酸化水平显著减低;细胞周期的G0/G1期比例增加，S期比例减低，周期相关信号分子p21和p53表达水平升高。Nalm-6细胞的裸鼠成瘤能力在干扰A20后显著降低;在Jurkat细胞和Reh细胞中，降低A20表达可以明显促进细胞凋亡，且捌亡相关分子BCL-2表达下调。三种细胞在下调A20表达后对化疗药物柔红霉素的敏感性增加。
　　研究结论:本研究表明A20在ALL中高表达，降低A20表达可以降低细胞的增殖能力，且抑制增殖相关的信号通路的活化，将更多的细胞阻滞在细胞周期的G0/G1期，更少的细胞进入S期。降低A20表达可以明显促进细胞的凋亡。在柔红霉素的化疗中，降低A20的表达可以增强细胞对化疗药物柔红霉素的敏感性。本研究提示A20在ALL细胞中起到抗凋亡，促进细胞增殖的作用，可能是白血病细胞中的一种新的致癌基因，为进一步的临床治疗提供依据。

目录

第一部分 Rac1 GTPase高度活化在造血干祖细胞恶性转化中的作用研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 A20对急性淋巴细胞白血病细胞生物学功能的影响及机制研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述

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