小鼠造血细胞和白血病细胞的重编程潜力及分子障碍探索

摘要

目的:
　　通过重编程因子(Oct4，Sox2，Klf4 and c-Myc)可以将已经分化的体细胞重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)[1,2]。细胞的重编程和肿瘤的发生有很多相似性，例如p53通路相关[3]。iPS技术在肿瘤细胞上的应用有助于我们更好的了解肿瘤发生和发展的潜在机制。到目前为止，一系列的肿瘤细胞已经能够成功的被重编程为多能性干细胞。在文献报道中证实，在造血系统中不仅各层级的正常的造血细胞能够被重编程，而且EBV转化的淋巴母细胞系，人类的慢性髓系细胞白血病(CML)，幼年型粒单核细胞白血病(JMML)，骨髓异常增生综合征(MDS)和原发的MLL-AF9诱导的小鼠急性髓系白血病(AML)等也都已经能够被重编程[4-9]。然而，由于原代肿瘤细胞体外很难扩增和培养，因而肿瘤细胞被重编程的效率极低，只有极少数种类和数目的肿瘤细胞能够被重编程。虽然，正常T淋巴细胞也能够被重编程[10]，然而恶性T淋巴细胞能否被重编程为多潜能性干细胞还没有被报道。在本研究中，我们拟进一步拓展白血病细胞重编程的范围，包括不同层级的MLL-AF9的AML细胞的重编程以及MLL-NRIP3诱导的AML和Notch1诱导的急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)且进一步探讨了白血病细胞重编程障碍的分子基础。
　　方法:
　　在我们的实验中，主要通过能够被Dox诱导表达四因子的转基因小鼠研究不同层级的造血细胞的重编程，并通过之前建立的MLL-AF9的AML模型，分选不同层级的白血病细胞诱导为iPS，比较之间的效率差异。同时在小鼠的造血干祖细胞中过表达MLL-NRIP3融合基因或Notch1基因建立了AML和T-ALL模型。分选的GFP阳性细胞可以在Dox的作用以及胚胎干细胞培养环境下被诱导为多潜能性干细胞。通过体外对多潜能性基因、标志物、细胞核型以及体内畸胎瘤、嵌合体的实验证明诱导多能性干细胞的全能性。同时，我们对白血病细胞在重编程过程中出现的两种克隆，并且对出现的这两种克隆进行基因芯片的分析，找出T-ALL白血病细胞重编程过程中相关分子障碍，并用相关小分子进行对重编程效率的干预研究。
　　结果:
　　不同层级造血细胞重编程的效率有很大的不同，HSPCs的重编程效率为1.2％，而粒细胞的效率仅为0.056％。MLL-AF9诱导的AML重编程效率极低，且白血病干细胞(LSC)不能够被重编程。过表达MLL-NRIP3融合基因和Notch1基因分别建立了AML和T-ALL的白血病模型。将分选的GFP阳性细胞即AML细胞和T-ALL细胞成功的转化为iPS细胞。并将这些白血病细胞来源的iPS细胞通过体内外实验鉴定，包括PCR表达相关多能性基因、免疫荧光、核型分析等体外鉴定，证实了建立的iPS细胞系与ES细胞具有相似的形态学特征，同时将形成的iPS细胞系注射到免疫缺陷小鼠(SCID)体内后可以产生具有三胚层结构的畸胎瘤，与正常细胞来源的iPS细胞相比其致瘤率无明显差别。我们对T-ALL来源的iPS细胞进行体内实验，证实能够产生嵌合鼠，进一步确认了白血病来源细胞的多能性。更为有趣的是，在T-ALL进行重编程的过程中，出现两种与胚胎干细胞形态相似的克隆。GFP-的克隆能够进行传代，而GFP+克隆不能够进行传代。进一步通过基因富集分析得出在GFP+克隆中与凋亡相关的分子，NF-κB，DOT1L, LSD1和HDAC相关的基因高表达。并且通过应用与之相关小分子抑制剂，能够提高TALL细胞重编程的效率。
　　结论:
　　我们的实验表明，不同层级之间的造血细胞重编程的效率不同，造血干组细胞重编程效率较高，而MLL-AF9诱导的AML重编程效率极低，且LSC不能够被重编程。原代的MLL-NRIP3诱导的AML和Notch1诱导的T-ALL细胞在体外都能够被重编程为对潜能干细胞。同时，T-ALL来源的iPS能够产生嵌合体小鼠，产生的这些嵌合体小鼠在一段时间内能自发的形成同种类型的白血病。在T-ALL细胞重编程的过程中，能够产生两种类型的克隆，通过两类的克隆进行分析，找到了相关肿瘤细胞重编程中的障碍，并且应用与之相关的小分子提高了T-ALL细胞重编程的效率。

目录

摘要

前言

英文缩略语

材料与方法

一、实验材料

二、实验流程

三、实验方法

实验结果

第一部分 正常造血细胞和MLL-AF9白血病细胞各层级的重编程

第二部分 构建MLL-NRIP3和Notch1白血病模型

第三部分 MLL-NRIP3诱导的AML细胞和Notch1诱导的T-ALL细胞的重编程

第四部分 Notch1诱导的T-ALL的重编程过程的分子障碍

讨论

总结

参考文献

综述

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