高尔基体蛋白ACBD3参与肠道病毒复制的机制研究

摘要

肠道病毒71型(EV71)是引起婴幼儿重症手足口病的主要病原体，其感染可导致严重的神经性疾病，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎和神经性肺水肿等。近年来大规模发生的手足口病疫情，严重危害婴幼儿、尤其是农村地区幼儿的身体健康，给公共卫生的发展带来巨大挑战。
　　EV71属于小RNA科病毒，报道表明小RNA病毒科病毒利用宿主细胞的内膜系统进行自身基因组的复制。病毒感染导致细胞内膜系统发生改变，富集病毒复制所需因子，形成不同于细胞内膜的膜结构，包含不同的蛋白组分和脂质组分，即病毒复制中心。病毒利用复制中心的宿主因子和病毒自身蛋白完成复制。最初报道表明高尔基体蛋白GBF1和ARF1在病毒复制中发挥重要作用。近年来发现，ACBD3介导嵴病毒3A蛋白募集病毒复制重要蛋白PI4KB至病毒复制中心。多种肠道病毒的3A蛋白也可以与ACBD3相互作用，但这种相互作用在不同病毒复制中的作用和机制不同，如柯萨奇病毒和鼻病毒的3A可以与ACBD3结合，但ACBD3并不参与二者的复制。目前，有关ACBD3在肠道病毒复制中的作用仍存在争议。前期通过酵母双杂交发现EV71的3A蛋白能与ACBD3相互作用。因此，本课题围绕ACBD3在EV71病毒复制中的作用和分子机制进行深入的研究，以期进一步阐明EV71的复制机制，发现潜在的抗病毒药物靶标，为病毒致病机理和抗病毒药物的设计研发提供理论依据。
　　通过外源性共转染3A和ACBD3蛋白，验证了ACBD3和3A的相互作用。进一步发现病毒感染后，EV713A也可以与内源性ACBD3共定位，并影响ACBD3在细胞内的分布。利用RNAi敲低ACBD3的表达，或是利用CRISPR/Cas9技术敲除ACBD3的表达后EV71病毒基因组的复制、蛋白的翻译及空斑形成能力均受到了抑制。而当回复ACBD3的表达后，病毒基因组的复制、蛋白的翻译及空斑形成能力又可以得到拯救。通过突变和免疫共沉淀定位了ACBD3与3A相互作用的关键区域，发现ACBD3的C端在其与3A结合中起着关键作用，而3A的41-86AA在其与ACBD3结合中十分重要。同时通过点突变发现EV713A的第44位异亮氨酸和第54位的组氨酸是二者相互作用中的关键位点。以上结果说明，ACBD3通过与EV71的3A蛋白结合参与病毒复制。
　　此外，参与EV71复制的另外一个重要分子是PI4KB，但在EV71复制中如何募集至复制中心还不是十分清楚。首先验证了PI4KB是否参与EV71复制，发现PI4KB的抑制剂能抑制EV71病毒的复制，同时，利用RNAi技术敲低PI4KB的表达或是利用CRISPR/Cas9技术敲除PI4KB的表达后EV71病毒基因组的复制、蛋白的翻译及空斑形成能力均受到了抑制。进一步研究PI4KB募集至复制中心的机制，发现EV713A能够增强PI4KB与ACBD3间的相互作用，并且感染后三者均定位于病毒的复制中心，同时，EV71病毒感染细胞后能导致复制中心附近PI4P的量的增加，而这些过程均需要ACBD3的参与。分子筛层析实验发现，在EV71病毒感染细胞后，会形成一个含有ACBD3，PI4KB，EV71-3A及EV71-3D的大分子复合物。EV71-3A第44位及第54位氨基酸的突变同样会抑制ACBD3与PI4KB的结合。最后，发现ACBD3同样参与到EV68病毒的复制过程中，而对HRV16病毒的复制不起作用。上述实验结果说明，PI4KB参与EV71病毒的复制，并通过形成3A-ACBD3-PI4KB分子复合物的形式促进EV71及EV68病毒的复制，而HRV16的复制机制还需后续深入研究。该研究结果阐述ACBD3在肠道病毒复制过程中的作用机制。
　　综上所述，本研究发现ACBD3通过与EV71病毒蛋白3A相互作用定位于病毒的复制中心，形成EV71-3A-ACBD3-PI4KB分子复合物的形式促进EV71复制，同时ACBD3参与了EV68病毒的复制，但并不参与HRV16病毒的复制。本研究发现了ACBD3参与EV71病毒及其他肠道病毒复制的机制，为阐明肠道病毒的致病和复制机制提供理论依据，为药物研发提供新的靶点。

目录

声明

摘要

缩略语和部分专有名词

引言

前言

实验研究工作

实验材料

实验方法

实验结果

1．参与肠道病毒复制的宿主因子的筛选

2．EV71病毒的非结构蛋白3A能与ACBD3相互作用

2．1 免疫共沉淀实验证实与ACBD3相互作用的病毒蛋白

2．2 GST Pull Down实验证实与ACBD3相互作用的病毒蛋白

2．4 EV71病毒的非结构蛋白与ACBD3相互作用

3．ACBD3与其他肠道病毒3A蛋白的相互作用

4．ACBD3在肠道病毒复制过程中的作用

4．1 敲低细胞内ACBD3的表达能抑制EV71病毒的复制

4．2 敲除细胞内ACBD3的表达抑制EV71病毒的复制

4．3 回复ACBD3的表达促进EV71病毒的复制

4．4 ACBD3在病毒入侵细胞阶段不起作用

4．5 ACBD3对其他肠道病毒复制的影响

5．EV71-3A与ACBD3相互作用位点的确定

5．1 ACBD3蛋白的C端在与EV71-3A结合过程中起作用

5．2 病毒蛋白3A的C端在与ACBD3结果过程中起作用

5．3 病毒蛋白3A第44位的异亮氨酸及第54位的组氨酸为EV71病毒复制所需的关键氨基酸

6．宿主因子GBF1及ARF1在EV71病毒复制过程中的作用

6．1 免疫荧光实验验证GBF1或ARF1与EV71-3A的相互作用

6．3 分子筛层析检测GBF1及ARF1

6．4 Confocal实验验证GBF1／ARF1与EV71-3A的定位情况

7．PI4KB在EV71病毒复制过程中的作用

7．3 敲除细胞内PI4KB的表达对EV71病毒复制的影响

8．宿主因子ACBD3参与肠道病毒复制的机制

8．2 EV71病毒感染促进ACBD3与PI4KB的结合

8．3 Confocal实验验证感染前后ACBD3与PI4KB间的定位情况

8．4 EV71病毒的3A蛋白的第44位异亮氨酸及第54位的组氨酸在促进ACBD3与PI4KB间的结合过程中起重要作用

9．1 流式检测分析EV71病毒感染前后胞内PI4P的变化

9．3 ACBD3在PI4P的生成过程中起重要作用

10．EV71病毒感染能形成病毒复制中心，宿主因子ACBD3在病毒复制中心形成过程中起重要作用

10．1 Confocal实验验证EV71病毒感染细胞能形成“病毒复制中心”

10．2 分子筛层析实验证实EV71病毒感染形成大分子复合物

10．3 宿主因子ACBD3在EV71病毒复制中心形成过程中起重要作用

11．宿主因子PI4KB在其他肠道病毒复制过程中的作用

讨论

总结

参考文献

博士在学期间发表的学术论文

致谢