缺血缺氧性脑损伤与脑缺血再灌注损伤的治疗方法初步探索——p66shc基因敲除、葡萄籽原花青素

摘要

脑血管病(cerebral vascular diseases，CVD)是危害人类健康及生命的三大疾病之一，而缺血性脑血管病(ischemic cerebralvascular disease，ICD)占其中大部分。我国CVD的患病率、发病率、病死率、致残率呈现逐年增高的趋势，迫切需要切实有效的治疗方法预防、抑制CVD的发生和发展，降低其社会危害。
　　缺血缺氧性脑损伤（hypoxic-ischemic brain injury, HIBI）是指因心跳呼吸骤停、窒息、电击、中毒等所导致的脑部缺血、缺氧性损害，并由此继发的躯体、神经、精神症状和体征的综合征。对于新生儿，HIBI是威胁其生命的主要疾病之一，幸存的患儿依然可以遗留永久性神经损伤，如脑瘫等。在成人，HIBI也是威胁生命的重要疾病:可发生于窒息、心跳骤停等，也可作为心肺复苏抢救成功后致命性的并发症，给患者本人、家庭及整个社会带来了沉重的经济负担和心理负担。脑缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion brain injury, IRBI)也可造成脑功能严重受损。IRBI分为两个阶段，即脑血流中断或血液供应严重不足、血流全部或部分恢复（再灌注），这两个阶段介导脑组织、脑细胞的氧化应激损伤，形成一个快速级联反应。上述过程包括多个环节，如能量匮乏、酸中毒、兴奋毒性氨基酸的合成或释放成倍增高、钙超载、氧化应激、炎性反应、凋亡启动等。其中，氧化应激-炎症反应在IRBI机制中的核心环节
　　目前广泛认为HIBI和IRBI的发病机理涉及氧化应激的产生。严重的急性血管急症或心跳骤停、窒息、点击、中毒等，使血糖和血氧供应严重不足，进而发生离子状态的失衡、兴奋毒性氨基酸的合成或释放成倍增高、钙超载，最终激活包括氧化应激和炎症反应在内的多条病理性信号转导通路，最终的解决是神经细胞死亡、脑损伤。因此若能通过基因干预手段或药物手段干扰氧化应激的病理过程，则有望改善HIBI和IRBI的预后。
　　第一部分 P66shc基因敲除对小鼠急性缺血缺氧性脑病发展的抑制作用及其机制研究
　　研究背景:
　　p66Shc基因编码的是磷酸化酪氨酸信号适配蛋白。p66Shc的第36位丝氨酸位点磷酸化修饰后，可通过对其下游信号转导通路的作用影响氧化应激、炎性反应、凋亡和血管生成。敲除p66Shc基因后，叉头转录因子(forkhead transcription factor,Foxp)的活性成倍增加:同时，抗氧化酶的表达及活性也相应增高。p66shc也可通过激发AKt依赖的磷酸化修饰过程使Foxp1及Foxp3a失活，促进活性氧族分子的生成。因此，p66Shc是氧化应激介导细胞凋亡的过程中及其重要的因子。
　　研究目的:
　　研究p66shc基因敲除是否可以抑制小鼠缺血缺氧性脑损伤的病程:探究p66shc基因敲除在干预小鼠缺血缺氧性脑损伤病程中对氧化应激、炎性反应、血管生成、凋亡、抗氧化酶表达等的作用。
　　研究方法:
　　首先提取鼠尾基因组DNA，用Southern杂交的方法进行基因鉴定:小鼠分为四组，设置对照、双盲、随机:制作小鼠缺血缺氧性脑损伤的模型，对血流动力学（局部脑血流量、收缩压、舒张压）和血生化进行检测:在造模后24小时，行颅脑核磁共振(magnetic resonance imaging, MRI)检查，计算并比较各组小鼠缺血缺氧性脑损伤灶的体积:利用改良神经功能评分(modified neurological severity score,mNSS)系统，测定并分析比较各组小鼠在造模后1小时、24小时、3天、7天的神经功能:在造模后24小时断头取脑切片，行免疫组化检查，分析比较脑损伤灶及周围区域NeuN、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、CD34、Bax和Bcl-2阳性细胞或组织的表达，行TUNEL荧光染色进一步评估凋亡程度:用Western Blot方法检测并比较个组小鼠在造模24小时后损伤侧脑组织匀浆中NADPH氧化酶亚基gp91Phox（作为p66shc的下游调控靶标）的表达:检测各组小鼠在造模24小时后血液中超氧阴离子自由基(superoxide anion free radical，SAFR)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)的表达水平，以此反映小鼠整体的、系统的氧化应激程度:测定各组小鼠在造模24小时后损伤侧脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)的表达，以此分析p66shc基因敲除对抗氧化酶活力的促进作用。
　　研究结果:
　　MRI结果显示p66shc基因敲除组小鼠缺血缺氧性脑损伤灶体积明显小于对照组（野生型，wild type）。p66shc基因敲除组小鼠神经功能恢复好于对照组(野生型，wild type):p66shc基因敲除组小鼠的mNSS评分低于对照组(野生型，wild type)，且自行恢复的能力高于对照组（野生型，wild type），差异具有统计学意义（由△mNSS评估）。p66shc基因敲除组小鼠缺血缺氧性脑损伤灶及其周边区的神经元存活数目（由NeuN反映）明显多于对照组(野生型，wild type)，差异具有统计学意义。p66shc基因敲除组小鼠缺血缺氧性脑损伤灶及其周边区的氧化应激程度（由8-OhdG反映）和炎性反应程度（由TNF-α反映）明显强于对照组（野生型，wild type），差异具有统计学意义。p66shc基因敲除能改善缺血缺氧性脑损伤小鼠的凋亡平衡:促进Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，抑制神经元的凋亡进程。p66shc基因敲除对小鼠脑组织中NADPH氧化酶(gp91phox)具有抑制作用。p66shc基因敲除抑制小鼠缺血缺氧性脑损伤介导的机体系统氧化应激（p66shc基因敲除组小鼠血液中的MDA和超氧阴离子自由基均低于对照组）。脑缺血再灌注损伤24小时后，p66shc基因敲除组小鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力高于对照组（野生型，wildtype），具有更强的抗氧化应激能力，差异具有统计学意义，也可能是其主要机制之一。
　　研究结论:
　　p66shc基因敲除可以抑制小鼠缺血缺氧性脑损伤的病程，保护神经功能，减少梗死灶体积。其机制可能是p66shc基因敲除抑制了小鼠缺血缺氧性脑损伤病程中局部脑组织和系统的氧化应激、炎性反应、凋亡，未明显抑制局部微血管生成，提高了抗氧化酶的表达和活力。
　　第二部分 葡萄籽原花青素提取物对小鼠脑缺血再灌注损伤的抑制作用及其机制研究
　　研究背景:
　　葡萄籽原花青素提取物(grape seed procyanidin extract, GSPE)是由黄烷醇衍生而来的多酚类化合物，在葡萄、蓝莓等许多种植物中大量存在:在生物化学上，GSPE是由表儿茶素、儿茶素经过缩合反应而来。研究发现，GSPE具有广泛的生物活性，如抗氧化活性、调节和改善免疫反应作用、抑制癌细胞的作用、抗氧化应激活性等。GSPE中含有大量的富电子羟基基团，具有非常强大的抗氧化应激、抗炎性反应、清理自由基等的作用，是目前发现的最强效的脂质过氧化抑制剂和活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的清除剂之一。
　　研究目的:
　　研究GSPE是否可以抑制小鼠脑缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion braindamage，IRBI)的病程:探究GSPE在干预小鼠IRBI病程中对氧化应激、炎性反应、血管生成、凋亡、抗氧化酶表达等的作用。
　　研究方法:
　　小鼠分为四组，设置对照、双盲、随机:在制作小鼠IRBI模型24小时后，行颅脑核磁共振(MRI)检查，计算并比较各组小鼠IRBI损伤灶的体积:利用神经损害评分(mNSS)系统，测定并分析比较各组小鼠在造模后1小时、24小时、3天、7天的神经功能:在造模后24小时断头取脑切片，行免疫组化检查，分析比较脑损伤灶及周围区域NeuN、CD34、Bax和Bcl-2阳性细胞或组织的表达:用专用试剂盒测定各组小鼠在造模24小时后损伤侧脑组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶[glutathione peroxidation(GSH-Px)]的表达，以此分析GSPE对抗氧化酶活力的促进作用。
　　研究结果:
　　MRI结果显示GSPE组小鼠IRBI损伤灶体积明显小于对照组（生理盐水组）。GSPE组小鼠神经功能恢复好于对照组（生理盐水组）:GSPE组小鼠的mNSS评分低于对照组（生理盐水组）。GSPE组小鼠IRBI损伤灶及其周边区的神经元存活数目（由NeuN反映）及微血管密度（由CD34反映）明显多于对照组（生理盐水组），差异具有统计学意义。GSPE能改善IRBI小鼠的凋亡平衡:促进Bcl-2的合成，抑制Bax的合成，抑制神经元的凋亡进程。小鼠脑缺血再灌注损伤24小时后，GSPE组小鼠脑组织中GSH-Px活力高于对照组（生理盐水组），具有更强的抗氧化应激能力，差异具有统计学意义，也可能是其主要机制之一。
　　研究结论:
　　GSPE可以抑制小鼠IRBI的病程，保护神经功能，减少梗死灶体积。其机制可能是GSPE抑制了小鼠IRBI病程中局部脑组织和系统的氧化应激、凋亡，促进了局部微血管生成，提高了抗氧化酶的表达和活力。

目录

英文缩略词表

摘要

第一部分 P66shc基因敲除对小鼠急性缺血缺氧性脑病发展的抑制作用及其机制研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

小结

第二部分 葡萄籽原花青素提取物对小鼠脑缺血再灌注损伤的抑制作用及其机制研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

小结

本课题研究的不足之处

文献综述一 氧化应激在急性脑缺血病程中的分子生物学作用

致谢

个人简历

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