葡萄籽原花青素对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

摘要

脑血管病是目前公认为危害人类健康最重要的疾病之一。而缺血性脑梗塞占全部脑血管病的60％-80％，它具有高发病率、高致残率及高复发率的特点。目前溶栓治疗方法在取得显著疗效的同时，也可引起部分患者发生缺血再灌注损伤，严重影响患者的预后。因此，预防和治疗脑缺血再灌注损伤一直是医学界研究的热点。 脑缺血再灌注损伤的病理过程极为复杂，迄今尚未明晰。一般认为它涉及多个环节，这些环节相互作用，相互影响，出现级联反应，可导致多形核白细胞粘附于内皮细胞、血脑屏障(blool-brainbarrier，BBB)被破坏、血管内容物渗出、神经元等组织水肿、坏死等病理过程。近年来，在脑缺血再灌注损伤的机制中，自由基损伤、炎症反应、NO的细胞毒作用和血脑屏障异常开放这四个环节越来越受到重视。 正是由于脑缺血再灌注损伤的发病机制涉及多个病理生理环节，在防治方面，临床上尚未寻找到理想有效的药物。目前鉴于单一用药效果差，普遍采用联合给药的方法。其缺点是药物之间易出现交叉反应，且有些药易导致毒副作用。由于植物药具有成分多重，作用多方面，无或仅有很低的毒副作用等优势，因此日益受到全球医学界的广泛关注。 近年来，研究者们发现葡萄籽原花青素(grapeseedprocyanidin，GSP)具有广泛的生理、药理及治疗作用，如清除自由基，抗氧化活性(此作用强于维生素C、维生素E)；心血管保护效应(包括抗血小板凝聚、抗心肌缺血再灌注损伤，抑制心肌细胞凋亡等)；抗炎、抗水肿、降低毛细血管通透性、免疫调节活性等等。正是由于GSP具有以上诸多确切的生物、药理学活性(多数与脑缺血再灌注损伤的发病机理有关)，且其来源广泛(葡萄籽是榨油业、酿酒业的下脚料，资源非常丰富)，毒副作用低(目前尚未见有毒副作用的报道)，因此，有望开发其成为预防及治疗脑缺血再灌注损伤的理想药物。然而，目前国内外对GSP在脑缺血再灌注损伤方面的研究，少见报道。本工作通过小鼠常压缺氧实验、小鼠断头实验及小鼠急性不完全脑缺血模型、小鼠脑缺血再灌注模型等，观察GSP对脑缺血、缺氧及再灌注损伤有否保护作用，并对其作用机制进行了一些探讨，以期为开发GSP成为防治脑缺血再灌注损伤的理想药物提供实验依据。 通过实验得出如下结果： 1.GSP对常压缺氧小鼠存活时间及耗氧量的影响 与正常对照组相比，GSP和Nim均能显著延长常压缺氧小鼠的存活时间(P＜0.01)，减少耗氧量，提高小鼠的耐缺氧能力(P＜0.01)。 2.GSP对小鼠断头后喘气维持时间的影响 与对照组相比，GSP和Nim均能不同程度地延长小鼠断头后喘气维持时间(P＜0.01)，表明GSP和Nim具有增强小鼠耐缺氧能力的作用。 3.GSP对小鼠急性不完全脑缺血的影响 与缺血模型组比较，各剂量组的GSP及Nim均能明显延长小鼠急性不完全脑缺血的存活时间(P＜0.01)。 4.GSP对脑缺血再灌注小鼠脑组织中EB含量的影响 脑缺血再灌注后72h脑组织EB含量高于假手术组(P＜0.01)。GSP及Nim治疗组与相应时间脑缺血再灌注组相比，脑组织EB含量明显降低(P＜0.01)。 5.GSP对脑缺血再灌注小鼠脑皮质血流的影响 再灌注72h后，脑缺血再灌注组与相应时间假手术组相比，脑皮质血流显著下降(P＜0.01)。GSP及Nim治疗组与脑缺血再灌注组相比，脑皮质血流明显增加(P＜0.05，P＜0.01)。 6.GSP对小鼠脑缺血再灌注后脑组织SOD、CAT、NOS活性和NO、MDA含量及总抗氧化能力(T-AOC)的影响 缺血再灌注组小鼠脑组织中SOD、CAT活性及T-AOC较假手术组明显减少，NOS活性及NO、MDA含量明显增加。GSP和Nim能不同程度的抑制缺血再灌注所致的SOD、CAT活性及T-AOC的下降和NOS活性及NO、MDA含量的增加。 7.GSP对脑缺血再灌注小鼠血清及脑组织中IL-1β、IL-10含量的影响 脑缺血再灌注组与假手术组相比，血清及脑组织中细胞因子IL-1β含量显著升高(P＜0.01)，IL-10含量下降(但无统计学意义)。GSP及Nim治疗组与脑缺血再灌注组相比，血清及脑组织中IL-1β明显降低(P＜0.01)，IL-10含量明显升高(P＜0.01，P＜0.05)。 8.GSP对脑缺血再灌注小鼠脑海马组织中细胞因子IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响 脑缺血再灌注组细胞因子IL-1β、TNF-α分别在313bp、456bp表达，图象分析表明，脑缺血再灌注时促炎因子IL-1β、TNF-αmRNA表达明显高于假手术组(P＜0.01)。不同剂量的GSP及Nim能不同程度地减少脑缺血再灌注时IL-1β、TNF-αmRNA表达(P＜0.01)。 9.GSP对脑缺血再灌注小鼠海马组织中MMP-2、MMP-9mRNA表达的影响 脑缺血再灌注后72小时可见MMP-2、MMP-9mRNA表达较假手术组增加(P＜0.01)，不同剂量的GSP及Nim能不同程度地减少MMP-9mRNA的表达量(P＜0.01)，而对于MMP-2mRNA表达无明显影响(P＞0.05)。 10.GSP对脑缺血再灌注小鼠海马CA1区脑组织病理形态学改变的影响 假手术组神经细胞胞膜清晰完整，无变形，水肿，核仁清晰可见。缺血再灌注组神经细胞肿胀变形，胞膜不清，出现不同程度的核深染、核固缩、核体不规则。间质水肿明显，细胞间隙增大。尼莫地平及GSP各组能不同程度的改善神经细胞的核深染、核固缩程度，减少细胞及间质的水肿，使胞膜清楚，形态正常，核仁清晰可见的神经细胞数目增多。 结论： 1.GSP能延长常压缺氧、不完全性脑缺血小鼠的存活时间以及脑缺氧小鼠张口喘气维持时间，并降低耗氧量，具有明显的抗脑缺血、缺氧作用。 2.GSP能改善小鼠海马CA1区由再灌注引起的神经细胞的核深染、核固缩程度，减少细胞及间质的水肿，使胞膜清楚，形态正常，核仁清晰可见的神经细胞数目增多，表明GSP具有抗脑缺血再灌注损伤的作用。 3.GSP能通过降低脑缺血再灌注所引起的BBB通透性的增强而保护BBB的完整性，从而发挥抗脑缺血再灌注损伤的作用。 4.GSP抗脑缺血再灌注损伤的作用可能与其具有下列作用有关： (1)GSP可降低NOS的活性，减少脑缺血再灌注时MDA、NO的生成，同时提高机体抗氧化酶如SOD、CAT的活性从而使机体总抗氧化能力提高并对抗NO的细胞毒作用。 (2)GSP可促进具有抗炎作用的细胞因子IL-10的生成，并减少具有促炎作用的细胞因子IL-1β、TNF-α含量及其mRNA表达，从而减轻炎症反应。 (3)GSP可减少MMP-9对脑毛细血管基底膜的降解，从而保护BBB的完整性。 (4)GSP具有增加脑缺血再灌注小鼠脑皮质血流的作用。

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论文一 葡萄籽原花青素对小鼠脑缺氧、缺血损伤及再灌注时抗氧化酶类和海马CA1区结构的影响

论文二 葡萄籽原花青素对脑缺血再灌注小鼠血清和脑组织中细胞因子、NO及其合酶和血脑屏障通透性的影响

论文三 葡萄籽原花青素对脑缺血再灌注小鼠明胶酶和脑皮质血流的影响

本研究的创新点

综 述 葡萄籽原花青素的研究进展

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