组蛋白甲基转移酶DOT1L在骨质疏松发病中的作用机制研究

摘要

骨质疏松症(Osteoporosis)是骨代谢失衡引起的系统性骨骼疾病，影响数亿人的健康。骨代谢平衡由执行骨吸收功能的破骨细胞和执行骨生成功能的成骨细胞共同维持。因此，研究影响破骨细胞及成骨细胞分化及功能的调节因素是认识骨质疏松发病机理的关键，并为骨质疏松提供潜在的治疗靶点。 表观遗传学是指在不改变DNA序列的前提下，通过某些机制引起可遗传的基因表达或细胞表型的变化。有证据表明表观遗传因素调节破骨细胞和成骨细胞的分化，但组蛋白翻译后修饰在破骨细胞和成骨细胞分化中的作用还没有得到深入的研究。本课题前期利用质谱筛选破骨细胞分化前后组蛋白翻译后修饰的改变，发现H3K79me在破骨细胞分化后水平上升，并且DOT1L表达量上调。体外细胞实验表明，利用小分子抑制剂抑制DOT1L的酶活性，或利用shRNA干扰DOT1L表达都能促进破骨细胞分化和骨吸收能力。小鼠体内实验显示，DOT1L抑制剂处理后能够加重卵巢摘除小鼠股骨和胫骨的骨丢失，并且增强骨头中破骨细胞活性。此外，体内和体外实验均表明，DOT1L不影响成骨细胞分化和钙结生成。 为了明确DOT1L如何调控破骨细胞分化，RANKL诱导RAW264.7分化作为破骨细胞分化模型，定量蛋白质组学技术用于定量检测DOT1L抑制剂EPZ5676处理后破骨细胞中的蛋白表达变化。结果表明DOT1L主要调节破骨细胞早期分化阶段，并主要调节线粒体蛋白、自噬相关蛋白和细胞骨架调节蛋白。这些差异蛋白与细胞中活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)产生、自噬活性和细胞迁移能力密切相关。进一步实验表明DOT1L抑制剂EPZ5676能够增加细胞中ROS水平、上调破骨细胞自噬活性、增强破骨细胞迁移能力。其中，ROS是DOT1L调节破骨细胞分化的关键因子，介导DOT1L对破骨细胞自噬和细胞迁移的调节。此外，DOT1L抑制后还引起其他增强破骨细胞分化和骨吸收的因素改变，例如，破骨细胞中细胞融合蛋白CD9和骨吸收蛋白MMP9表达增强，破骨细胞分化中的重要转录因子NFATc1和NF-κB转录活性增加。 综合以上研究结果，本课题发现DOT1L调节的、H3K79me介导的表观遗传调节调控破骨细胞分化，参与骨质疏松发病，提示DOT1L以及DOT1L调节的蛋白网络可以作为治疗骨质疏松的潜在靶点。

目录

摘要

中英文对照及缩略词

1．研究背景

1．1骨质疏松症

1．2破骨细胞和成骨细胞

1．3表观遗传学调节(Epigenetic regulation)在破骨细胞及成骨细胞分化中的作用

1．4本课题研究目的

2实验方法与材料

2．1实验材料

2．2实验试剂配制

2．3体外破骨细胞分化及骨吸收实验

2．4从RAW264．7和破骨细胞中抽提组蛋白(酸抽提法)

2．5慢病毒介导稳定敲低DOT1L的RAW264．7细胞株构建

2．6基于TMT标记的蛋白质组学实验

2．7液质联用质谱检测

2．8生物信息学分析

2．9 Western Blot

2．10小鼠卵巢摘除术及渗透泵载药

2．11小鼠骨头TRAP染色和免疫组化

2．12免疫荧光

2．13流式检测氧自由基生成和自噬活性

2．14 Transwell细胞迁移实验

2．15 MTT法检测EPZ5676和EPZ004777处理后RAW264．7增殖变化

2．16统计学分析

3．研究结果

3．1组蛋白H3K79me1／2在破骨细胞分化中上调(1％FBS诱导模型)

3．2 DOT1L抑制剂EPZ004777抑制破骨细胞分化(BMCs诱导模型)

3．3 DOT1L抑制剂EPZ5676和EPZ004777不影响成骨细胞分化

3．4 BMCs诱导分化的破骨细胞中EPZ004777上调促进破骨细胞分化的因子

3．5 DOT1L抑制剂促进破骨细胞分化和骨吸收(10％FBS诱导模型)

3．6抑制DOT1L加重卵巢摘除鼠(OVX mice)骨质丢失

3．7组蛋白H3K79me1／2甲基化在破骨细胞分化中上调(10％FBS诱导模型)

3．8 EPZ5676和EPZ004777选择性抑制DOT1L的甲基转移酶活性

3．9敲低DOT1L增强破骨细胞的细胞融合和骨吸收活性

3．10 DOT1L在RAW264．7和破骨细胞中调节不同的蛋白

3．11前破骨细胞中DOT1L调节蛋白参与破骨细胞生成和细胞活力，而破骨细胞中DOT1L调节蛋白参与骨吸收

3．12 DOT1L调节前破骨细胞中细胞电子传递链、自噬和迁移相关蛋白，并上调破骨细胞中CD9和MMP9表达

3．13 DOT1L受到抑制后促进ROS生成、细胞自噬和细胞迁移

3．14 EPZ5676处理能够增强NFATc1和NF-κB转录活性

4．讨论

5．综述

参考文献

附录

博士期间发表的论文

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致谢