组蛋白甲基转移酶Dot1l在天然免疫应答中的调控作用及表观机制研究

摘要

在受到病原微生物侵袭的情况下，机体天然免疫系统能迅速感知入侵的病原体，发挥免疫防御功能，维持内环境稳态。天然免疫细胞可表达多种类型的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)并在抵御病原体过程中发挥了重要作用，其能通过识别特定的病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)或损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，活化天然免疫反应信号通路，产生炎性细胞因子和I型干扰素从而发挥抗感染功能。这其中涉及的天然免疫信号通路主要包括:Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)识别相应配体后引起的下游NF-κB、MAPK和IRF3通路活化;RIG-I样受体(RIG-I-like receptors，RLRs)识别RNA后引起的下游IRF3通路活化以及NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)所诱导的NF-κB和MAPK通路活化。　　天然免疫活化后会诱导一系列炎性细胞因子的表达，诱发炎症反应，这是机体抵御感染、清除入侵的病原体所必需的。然而炎性细胞因子和I型干扰素的大量产生会导致过度的炎症反应，损伤正常的组织器官。因此，天然免疫的活化需要通过多种方式进行严格的调控，以确保其适度活化，既能清除病原体，又不会损伤自身。目前比较受到关注的天然免疫调控主要涉及两大方面:其一是天然免疫信号通路相关蛋白的翻译后修饰(posttranslational modifications，PTMs)，包括磷酸化、泛素化等。这些蛋白的翻译后修饰通常发生在胞浆当中，已经得到相对充分的研究。其二是炎性细胞因子和I型干扰素产生所受到的直接或间接的表观调控。最新的研究显示天然免疫的活化会导致细胞核的重编程以及表观因子的表达变化，这说明天然免疫的适度活化离不开表观因素的调控，因此近年来天然免疫表观调控领域的研究受到较多的关注。但由于表观修饰的复杂性、多样性，许多表观调控分子在天然免疫调控中的作用及调节机制仍不清楚。　　不同类型的表观修饰在基因表达调控中具有不同的功能。DNA甲基化修饰和基因表达沉默、转录抑制密切相关，组蛋白乙酰化则促进基因的转录。与这两者不同的是组蛋白甲基化修饰对基因的表达调控并非是单一的，修饰位点不同、甲基化程度不同，其对基因表达的影响也就不同。已有的研究显示组蛋白3第4位赖氨酸的3甲基化(trimethylation of histone3lysine4，H3K4me3)、H3K36me3及H4K20me1通常作为转录活化的标志，而H3K9me3、H4K20me3和H3K27me3则会介导转录抑制。组蛋白赖氨酸甲基转移酶(histone lysine-specific methyltransferases，KMTs)和组蛋白赖氨酸去甲基化酶(histone lysine-specific demethylases，KDMs)可以动态调控组蛋白的甲基化状态，从而控制基因表达。表观修饰在生物体的胚胎发育、机体衰老和肿瘤发生等多方面发挥了重要的功能。近些年来，表观修饰与炎症反应和天然免疫活化的关系也得以研究，已有多个位点的组蛋白甲基化修饰被证明和天然免疫反应相关。组蛋白H3K79位点的甲基化修饰在基因的表达调控中也起着重要作用，该位点的甲基化修饰通常和转录活化相关。目前关于H3K79位点甲基化修饰功能的研究多集中于细胞分化、DNA损伤修复、端粒沉默等方面，其在天然免疫调控中的作用及其对炎性细胞因子表达的影响尚不清楚。　　迄今为止，H3K79位点唯一明确的组蛋白甲基化修饰酶是Dot11，其能催化H3K79位点单/双/三甲基化修饰。已证明Dot11参与了白血病、乳腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤的发生和发展。作为一个可以调控基因表达的组蛋白修饰酶，其在调控天然免疫活化中或许也发挥着重要的功能，本课题对这一问题进行了深入研究。　　对小鼠腹腔巨噬细胞分别进行TLR配体LPS、Poly(I:C)刺激或水泡口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)感染后，用ChIP实验检测Il6、Ifnb1和Tnfa启动子区H3K79me2/3修饰的变化，结果显示在不同的处理后Il6和Ifnb1启动子区H3K79me2/3修饰均上升，但Tnfa启动子区只出现H3K79me2修饰增加，H3K79me3并未有明显变化。进一步实验发现小鼠腹腔巨噬细胞在TLR3配体Poly(I:C)、TLR4配体LPS以及VSV处理后，Dot11蛋白表达均呈现先上升后下降的变化趋势。对人单核细胞THP1进行LPS刺激或VSV感染也得到了相同结果。进一步用靶向Dot1l的siRNA和慢病毒分别干扰小鼠腹腔巨噬细胞和人THP1中的Dot11表达，发现干扰Dot11后可抑制TLR受体活化诱导的IL-6、IFN-β的产生以及RIG-I受体活化诱导的INF-β的产生，但对TNF-α的表达没有显著影响。机制研究发现干扰Dot11的表达对小鼠腹腔巨噬细胞中NF-κB、MAPK和IRF3信号通路的活化并没有显著影响。进一步检测了天然免疫活化后Dot11在Il6、Ifnb1、Tnfa启动子区的募集情况，发现小鼠腹腔巨噬细胞LPS或Poly(I:C)刺激后能促使Il6启动子区的Dot11募集增加，但Tnfa启动子区并未出现Dot11的结合。LPS、Poly(I∶C)刺激或VSV感染也能促使Ifnb1启动子区Dot11的募集。干扰小鼠腹腔巨噬细胞或人THP1中的Dot11表达则能抑制天然免疫活化后Il6、Ifnb1启动子区H3K79me2/3的修饰。　　综上所述，Il6和Ifnb1的转录活化和其启动子区的H3K79me2/3修饰密切相关。天然免疫活化后，Dot11能够选择性地结合到Il6和Ifnb1启动子区，催化H3K79me2/3修饰，增强其转录活性，从而促进IL-6和IFN-β的表达。我们的研究揭示了H3K79位点甲基化修饰与天然免疫反应的关系以及Dot11在调控天然免疫反应中的功能，可为炎症性和感染性疾病的研究与治疗提供潜在的靶标。

目录

声明

摘要

缩略词表

一、引言

二、材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

三、实验结果

1．天然免疫诱导Il6和Ifnb1启动子区的H3K79me2／3甲基化修饰升高

2．TLR配体刺激或RNA病毒感染诱导巨噬细胞Dot1l表达升高

3．沉默Dot1l能够抑制TLR受体活化诱导的IL-6、IFN-β以及VSV感染诱导的IFN-β产生

4．Dot1l不影响天然免疫NF-κB、MAPK和IRF3信号通路的活化

5．TLR配体刺激或VSV感染诱导Dot1l结合到Il6、Ifnb1启动子区增加

6．沉默Dot1l能够抑制Il6、Ifnb1启动子区的H3K79me2／3修饰

四、讨论

五、总结

本课题主要得出以下结论

本课题的创新点和研究意义

本课题需要进一步研究的问题

参考文献

综述 组蛋白修饰在天然免疫应答及炎症反应中的调控作用

作者简历、研究生期间发表的论文及国内外学术交流

致谢