RBL--2H3细胞评价5--HMF及其二聚体OMBF的体外免疫毒性以及PLNA评价3种中药注射液的免疫原性

摘要

5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural，5-HMF)是美拉德反应或焦糖化反应的主要产物，是分子量为126.11的小分子化合物，广泛存在于含糖的药物、食物中。研究表明，5-HMF具有抗氧化、抗肿瘤、抗组织缺血等药理作用，也具有肾毒性和潜在遗传毒性。中华人民共和国药典规定，5-HMF在葡萄糖注射液中限量为11.8μg·mL-1，前期分析了市面上在售的多批次中药注射剂(Traditional Chinese Medicine Injections，TCMIs)中5-HMF的含量，一些注射剂中其含量远远大于此标准。此外，在含5-HMF浓度较高的注射液中还检测到一定浓度的5-HMF聚合物，经鉴定主要为5-HMF的二聚体，即双-（5-甲酰基糠基）醚(5，5'-Oxydimethylenebis(2-furfural)，OMBF)。随着TCMIs在临床上的广泛应用，其不良反应报道也日益增加，其中发生率最高的为免疫介导的药物超敏反应(Immune-mediated drug hypersensitivity reaction，IDHR)，包括类过敏反应和Ⅰ型超敏反应。5-HMF聚合物是糖降解产生5-HMF单体的过程中常见的一种副产物，其潜在毒性尚未引起关注。 本论文第一部分选用体外肥大细胞模型:大鼠嗜碱性白血病细胞(Basophilic leukemia cell line2H3，RBL-2H3)对5-HMF单体及其二聚体OMBF的潜在免疫毒性，包括类过敏及Ⅰ型超敏反应进行系统评价。首先对RBL-2H3细胞的体外生长特性及脱颗粒激发条件进行摸索，成功建立RBL-2H3肥大细胞活化脱颗粒模型。在此实验条件下，开展5-HMF和OMBF直接诱导RBL-2H3细胞脱颗粒发生类过敏反应实验，以及诱导致敏后的RBL-2H3细胞活化发生Ⅰ型超敏反应实验，通过观察RBL-2H3细胞形态，测定β-氨基糖苷酶（β-Hexosaminidase，β-HEX）释放率、组胺(Histamine，His)释放率、Ca2+含量，以及不同浓度下对白介素6(Interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)生成的影响。主要结果如下: (1)RBL-2H3细胞最适铺板密度为1×105个/mL，整个实验过程在72小时内完成;5-HMF与OMBF的IC50分别为4.96mM和5.35×10-2mM，OMBF的毒性大于5-HMF，相差约100倍; (2)模型组造模浓度为0.5μg/mL抗DNP-IgE单抗与细胞孵育过夜，100ng/mLDNP-HSA激发细胞脱颗粒，此外选定孵育时间选为2h，进行后续的实验开展; (3)体外类过敏免疫毒性评价结果显示，5-HMF低剂量(0.1IC50)、OMBF低剂量(0.1IC50)组能显著性促进β-HEX和His的释放，刺激IL-6的分泌，OMBF高剂量组(IC50)中，His释放量、胞内Ca2+浓度和TNF-α、IL-6的分泌量均显著性升高; (4)体外Ⅰ型超敏免疫毒性评价结果显示，5-HMF高剂量（10倍临床最大暴露量）刺激下，β-HEX、His释放率，TNF-α和IL-6分泌量均与空白对照有显著性升高，OMBF高剂量组（10倍临床最大暴露量）细胞形态发生脱颗粒变化，β-HEX、His的释放率和TNF-α的分泌，以及细胞内Ca2+浓度显著性升高。 我们可以得出结论，在利用RBL-2H3评价受试物的类过敏免疫毒性实验中，5-HMF低剂量(0.1IC50)，OMBF低(0.1IC50)、高剂量(IC50)均刺激肥大细胞活化脱颗粒，释放活性介质，发生类过敏反应。在评价Ⅰ型超敏免疫毒性实验中，5-HMF和OMBF以临床最大暴露量10倍的浓度致敏BN大鼠，获得血清孵育肥大细胞后，在IC50浓度下，刺激肥大细胞活化脱颗粒，发生Ⅰ型超敏反应，具有体外免疫毒性。 我们先前的研究发现，5-HMF和OMBF可能与含糖中药注射液引发的免疫刺激（如超敏反应和自身免疫反应）有一定的相关性，结合第一部分5-HMF和OMBF具有体外免疫毒性的实验结果，本论文第二部分选取了3种含有5-HMF和OMBF的中药注射液:脉络宁、生脉和丹香冠心，利用小鼠直接腘窝淋巴结(Direct-popliteal lymph node assay，D-PLNA)和报告抗原腘窝淋巴结(Reporter antigen-popliteal lymph node assay，RA-PLNA)对3种受试物进行免疫原性评价。主要研究内容为分别建立D-PLNA和RA-PLNA模型，报告抗原为三硝基苯基聚蔗糖(2，4，6-trinitropheny-Ficoll，TNP-Ficoll)和三硝基苯基卵蛋白(TNP-ovalbumin，TNP-OVA)。足趾部给药后，测定足趾厚度，D7剖杀分离腘窝淋巴结，制备淋巴单细胞悬液并进行细胞计数，计算细胞指数;将细胞悬液培养于孔板中，与刺激剂共孵育后，测定细胞上清液中免疫球蛋白IgE和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量变化。主要结果如下: (1)D-PLNA评价3种TCMIs免疫原性:丹香冠心注射液组给药后足肿胀明显，淋巴结计数显著增加;脉络宁、生脉注射液对小鼠腘窝淋巴结(Popliteal lymph node assay,PLN)未产生明显的阳性反应。 (2)RA-PLNA评价3种TCMIs免疫原性:各给药组与TNP-Ficoll作用时，细胞数目和MCP-1浓度均显著升高，与TNP-OVA作用时，脉络宁注射液能显著性刺激IgE分泌，同时丹香冠心注射液IgE和MCP-1含量显著性差异升高。 脉络宁和生脉注射液中存在小分子物质诱发免疫反应，而丹香冠心注射液成分复杂，可能同时能直接诱导Ⅰ型超敏反应，也有作为半抗原的小分子物质与报告抗原结合诱发超敏反应。 综上所述，本研究成功建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型，并对5-HMF和OMBF体外免疫毒性进行系统评价，我们首次发现5-HMF和OMBF可能同时引起体外肥大细胞发生类过敏反应和Ⅰ型超敏反应，二聚体OMBF的生成增加了5-HMF的免疫毒性，PLNA的结果进一步证明了5-HMF及OMBF可能在中药注射液中作为小分子半抗原与体内蛋白相结合造成免疫系统的失调。对5-HMF和OMBF的体外免疫毒性评价以及对3种中药注射剂的免疫原性评价，为中药注射剂的临床不良反应的防治提供新的依据，同时对相关中药注射液中小分子物质5-HMF单体及二聚体OMBF的质量控制和深入研究非常必要。

目录

缩略词

摘要

前言

1．5-HMF及其二聚体OMBF研究背景

2．类过敏及超敏反应

3肥大细胞脱颗粒体外模型

4研究目标

5技术路线

第一部分 RBL-2H3细胞评价5-HMF及其二聚体OMBF的体外免疫毒性

第一章 RBL-2H3细胞活化脱颗粒模型的建立

材料与方法

结果

总结

第二章RBL-2H3细胞体外评价5-HMF和OMBF类过敏免疫毒性

材料与方法

结果

总结

第三章RBL-2H3细胞体外评价5-HMF和OMBF Ⅰ型超敏反应研究

材料与方法

结果

总结

讨论

第二部分 PLNA评价3种中药注射液的免疫原性

前言

1实验材料

2试验方法

3统计学处理

1三种中药注射剂对足趾厚度的影响

2三种中药注射剂对细胞计数的影响

3三种中药注射剂对细胞因子的影响

讨论

参考文献

文献综述 肥大细胞脱颗粒机制及体内外研究进展

致谢

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