泡桐属DNA条形码的筛选与鉴定研究

摘要

泡桐属（Paulownia）是玄参科(Scrophulariaceae)中的一个属，树种为乔木。泡桐是原产于中国的重要速生用材树种和绿化树种之一，发展泡桐生产在国民经济中有重要价值。目前泡桐存在优良基因资源容易流失，有些种群数量较少的野生资源的极具减少，商品用材品种混乱，用材品质不一等严重问题，需要得到准确的鉴定，DNA条形码技术是当下较好的解决途径之一。
　　DNA条形码（DNA barcoding）技术是一种基于DNA分子进化原理，利用标准DNA片段和现代分子系统学的原理和方法对“传统物种”进行快速、准确和自动化的身份鉴定的最新生物学技术。DNA条形码类似于超市里不同的商品对应的可扫描条形码。本研究以泡桐属为研究对象，利用DNA条形码技术，解决泡桐属密切相关种的鉴定问题，对于泡桐属植物近缘种鉴定、优良用材亲本选择具有较高参考价值。同时筛选和建立泡桐属DNA条形码，以期为构建泡桐属植物的可视数字化的数据库奠定基础。
　　本研究选取叶绿体、核基因、线粒体基因上的rps16、TrnK、rps2、rbcL、ITS2、ETS、nad1 intron2 DNA片段总计8个，提取泡桐属12种2变种共51份材料的DNA，进行PCR扩增及其产物直接测序，通过扩增效率和测序成功效率，用以研究DNA条形码片段在泡桐属中的通用性，同时分析其序列特征;本研究重点筛选了5个DNA条形码候选序列rps16、TrnK、ITS2、ETS，TrnL-F，用于泡桐属DNA条形码的分析和鉴定研究。研究结果如下:
　　(1)8个DNA条形码片段在泡桐属中的通用性分析:PCR扩增效率和测序成功率是评价DNA条形码序列的2个重要指标。rps16、TrnK、trnL-F、rps2、rbcL、nad1intron2、ITS2、ETS8个DNA片段的PCR扩增效率为100％，测序成功率为69.8％～100％。发现各DNA片段在泡桐属中均显示出较好的通用性，故可将其作为泡桐属DNA条形码候选序列开展进一步实验。
　　(2)DNA条形码序列特征分析:8个DNA片段的全序列比对排列后的长度分别为239 bp～1828 bp;总变异位点数分别为2～84个，其中碱基替换位点数分别为2～83个。GC含量分别为33.14％～72.19％。其中TrnK序列分析表明，在兰考泡桐，其中在1660bp的位点插入G，被鉴定。其中ITS2序列分析表明，山明泡桐在188 bp位点插入A，作为山明泡桐的特异位点被鉴定。其中ETS序列分析表明，楸叶泡桐在191 bp位点上碱基缺失（C→-），238bp位点上(G→A)，304 bp位点上(A→C)。楸叶泡桐因为这些特异序列特征，可以被鉴定。
　　综上所述，rps16、TrnK、ITS2、ETS序列的变异位点较多，说明它们在泡桐属中的进化速率较快，可用于泡桐属的系统学和分类学的研究。
　　(3)泡桐属DNA条形码的筛选和鉴定:通过种内种间的变异性，Barcodinggap的分析，种的鉴别效率来衡量rps16、TrnK、ITS2、ETS TrnL-F5个DNA片段的有效性。结果如下:
　　rps16序列的种间变异变异度为0.027％，平均变异(Theta prime)为0.031％，种间最小变异为0;种内变异度为0.021％，平均变异（Theta）为0.025％，种内最大变异（Coalescent dept）为0.052％。 Barcoding gap图示rps16存在barcoding gap。通过BLAST1方法鉴定效率达13.33％。
　　TrnK序列的种间变异度为0.091％，平均变异为0.090％，种间最小变异为0.012％;种内变异度为0.048％，平均变异为0.052％，种内最大变异为0.063％。通过BLAST1方法显示TrnK序列的鉴定效率达21.42％。
　　ITS2序列的种间平均变异为2.096％，种间最小变异为0.186％;平均变异为0.822％，种内最大变异为1.354％。总体来说，种间的变异较大，种内变异较小。barcoding gap图显示ITS2序列存在barcoding gap。BLAST1方法对ITS2序列鉴定效率达50％。ITS2二级结构分析图显示兴山泡桐具有4个茎环，优先鉴别出来;台湾泡桐，华东泡桐均具有5个茎环，结构很相似，但还是有细微的区别，如相比华东泡桐的结构，台湾泡桐的结构在最长的碱基对上，多了一个内环。这充分证明了ITS2二级结构的分析，对于泡桐的鉴别具有重要意义。综合发现ITS2序列可以做为泡桐属物种的候选DNA条形码片段。
　　ETS种间变异变异度为3.555％，平均变异为3.906％，种间最小变异为0.544％;种内变异度为1.697％，平均变异为1.542％，种内最大变异为2.895％。总体来说，种间存在较大的变异。BLAST1和Nearest Distance方法显示ETS的鉴定效率达28.57％，有一定的鉴定能力。
　　TrnL-F序列的种间变异变异度为0.142％，平均变异为0.132％，种间最小变异为0.008％;种内变异度为0.096％，平均变异为0.065％，种内最大变异为0.127％。总体来说，种内种间的变异都不大。所示序列种内变异和种间变异重叠比列大，无明显的的barcoding gap。
　　综合理想条形码的指标分析揭示出:rps16、TrnK、ITS2、ETS片段适合作为泡桐属的DNA条形码候选序列。利用TrnK+ITS2+ETS复合片段的序列比对，鉴定出泡桐属9种2变种，本研究推荐以TrnK+ITS2+ETS复合片段，作为泡桐属的DNA条形码候选序列。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 国内外研究现状及评述

1．2．1 泡桐属用材林植物鉴定技术分类及研究进展

1．2．2 林木植物领域的分子鉴定技术

1．2．3 DNA条形码技术

1．3 研究目标和主要研究内容

1．4 本研究的技术路线

第二章 泡桐属植物DNA条形码序列的通用性研究及序列特征分析

2．1 材料

2．2 方法

2．2．1 基因组DNA提取与纯化

2．2．2 引物筛选和PCR扩增

2．2．3 PCR产物回收

2．2．4 回收产物与pMD 18-T vector连接及转化

2．2．5 数据处理方法

2．3 结果与分析

2．3．1 PCR扩增效率和测序成功率

2．3．2 rps16的序列特征分析

2．3．3 TrnK的序列特征分析

2．3．4 ITS2序列特征分析

2．3．5 ETS序列特征分析

2．3．6 TrnL-F序列特征分析

2．3．7 rps2序列特征分析

2．3．8 rbcL序列特征分析

2．3．9 nad1 intron2序列特征分析

2．4 讨论

2．4．1 rps16序列分析和变异位点的探讨

2．4．2 TrnK序列分析和变异位点的讨论

2．4．3 ITS2序列分析和变异位点的讨论

2．4．4 ETS序列分析和变异位点的探讨

2．4．5 TrnL-F序列分析和变异位点的讨论

2．5 本章小结

第三章 泡桐属植物DNA条形码鉴定研究—rps16鉴定

3．1 材料

3．2 方法

3．2．1 基因组DNA提取与纯化

3．2．2 PCR扩增

3．2．3 PCR产物回收

3．2．4 回收产物与pMD 18-T vector连接及转化

3．2．5 数据处理方法

3．3 结果与分析

3．3．1 种内种间差异分析

3．3．2 Barcoding gap检验

3．3．3 泡桐属DNA条形码候选序列鉴定效率评价

3．4 讨论

3．4．1 DNA条形码候选序列有效性的比较

3．5 本章小结

第四章 泡桐属植物DNA条形码鉴定研究—TrnK鉴定

4．1 材料

4．2 方法

4．2．1 基因组DNA提取与纯化

4．2．2 PCR扩增

4．2．3 PCR产物回收

4．2．4 回收产物与pMD 18-T vector连接及转化

4．2．5 数据处理方法

4．3 结果与分析

4．3．1 种内种间差异分析

4．3．2 Barcoding gap检验

4．3．3 泡桐属DNA条形码候选序列鉴定效率评价

4．4 讨论

4．5 本章小结

第五章 泡桐属植物DNA条形码鉴定研究—ITS2鉴定

5．1 材料

5．2 方法

5．2．1 基因组DNA提取与纯化

5．2．2 PCR扩增

5．2．3 PCR产物回收

5．2．4 回收产物与pMD 18-T vector连接及转化

5．2．5 数据处理方法

5．3 结果与分析

5．3．1 种内种间差异分析

5．3．2 Barcoding gap检验

5．3．3 泡桐属DNA条形码候选序列鉴定效率评价

5．3．4 ITS2二级结构的初步分析

5．4 讨论

5．4．1 DNA条形码候选序列-ITS2有效性的比较

5．4．2 ITS2序列在林木植物鉴定中的作用

5．4．3 ITS2序列未鉴定成功样本的研究探讨

5．5 本章小结

第六章 泡桐属植物DNA条形码鉴定研究—ETS鉴定

6．1 材料

6．2 方法

6．2．1 基因组DNA提取与纯化

6．2．2 PCR扩增

6．2．3 PCR产物回收

6．2．4 回收产物与pMD 18-T vector连接及转化

6．2．5 数据处理方法

6．3 结果与分析

6．3．1 种内种间差异分析

6．3．2 Barcoding gap检验

6．3．3 泡桐属DNA条形码候选序列鉴定效率评价

6．4 讨论

6．5 本章小结

第七章 泡桐属植物DNA条形码鉴定研究—TrnL-F鉴定

7．1 材料

7．2 方法

7．2．1 基因组DNA提取与纯化

7．2．2 PCR扩增

7．2．3 PCR产物回收

7．2．4 回收产物与pMD 18-T vector连接及转化

7．2．5 数据处理方法

7．3 结果与分析

7．3．1 种内种间差异分析

7．3．2 Barcoding gap检验

7．3．3 泡桐属DNA条形码候选序列鉴定效率评价

7．3．4 DNA条形码序列对泡桐属的鉴别

7．4 讨论

7．5 本章小结

第八章 结论与展望

8．1 结论

8．1．1 所测样品的序列特征分析

8．1．2 泡桐属DNA条形码的筛选

8．1．3 应用DNA barcoding片段对泡桐的鉴别

8．1．4 应用DNA barcoding复合片段对泡桐的鉴别

8．2 展望

8．2．1 条形码领域的展望

8．2．2 系统学和遗传分类学领域的展望

8．2．3 杂种或杂种亲本的理论研究的展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢