水飞蓟种子活性成分的提取、分离及初步活性研究

摘要

水飞蓟素是从菊科植物水飞蓟种子中提取出的黄酮类天然化合物，在医药、保健品、化妆品及饲料工业等领域应用广泛。科研工作者们一直将水飞蓟素及水飞蓟宾视为研究热点，但对其单体化合物尤其是各对映体研究较少；现存提取工艺产率低、溶剂残留高；现存分离纯化方法处理量低、应用成本较高；活性研究多以水飞蓟素或水飞蓟宾为底物，药物机理尚不完全清楚；缺乏完善的过程模拟计算方法。这些问题都严重阻碍了该技术的进一步发展。因此，建立高效、廉价、简便的提取工艺和分离纯化方法，完善相关提取和分离过程的模型化研究具有非常重要的理论与实际意义。
　　 本论文通过水飞蓟素有效成分提取影响因素的研究，优化了酶法辅助提取工艺。建立了水飞蓟主要活性单体化合物的制备分离方法，并对其主要单体化合物的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性进行了初步考察。主要研究内容及取得的研究成果有如下几个方面：
　　 (1)建立了UPLC测定水飞蓟提取物的主要活性成分的分析方法
　　 首次建立了一种新的快速的UPLC测定水飞蓟提取物中主要有效成分的分析方法。与改进的HPLC方法相比，新的UPLC方法的分析时间缩短了4/5，溶剂消耗节省了9/10。
　　 (2)建立了酶法辅助提取水飞蓟宾的工艺
　　 以水飞蓟宾为提取目标物，在正交实验基础上，首次应用响应面法系统研究了酶解pH值、酶解温度和脱脂种皮粒径对酶法辅助乙醇提取水飞蓟宾的影响。在酶解液pH值(4.5)、酶解温度(40℃)、脱脂水飞蓟粒径(700μm)的最优工艺条件下，水飞蓟宾总提取率为24.60mg/g。与传统的回流提取、超声和微波提取比较，水飞蓟宾的产率分别高出136.0％、50.92％和43.02％；纯度分别高出：106.7％、111％和139.1％。
　　 (3)建立了制备色谱纯化水飞蓟提取物的主要活性化合物对照品的方法
　　 以水飞蓟宾晶体为原料，用响应面法系统研究了制备色谱分离制备高纯度水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的色谱操作参数。确定的最优操作条件为：流量(8mL/min)，进样体积(3mL)，流动相比例(40∶60，V/V)。
　　 以水飞蓟宾结晶母液浓缩液为原料制备新分离得到四种化合物。经初步结构鉴定：一种为花旗松素的同分异构体、两个为水飞蓟亭的同分异构体和一个为水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的另一种构象形式。
　　 (4)建立了逆流色谱大规模制备分离水飞蓟提取物主要活性化合物的方法
　　 以水飞蓟提取物为原料，建立了以羟丙基-β环糊精为手性添加剂的高速逆流色谱拆分水飞蓟宾对映体的新方法。制得的水飞蓟宾B和异水飞蓟宾A纯度都达到95％以上。
　　 以水飞蓟宾结晶母液的浓缩物为原料，建立了高速逆流分离制备高纯度水飞蓟宁、水飞蓟亭和花旗松素的新方法。此方法同时可回收部分水飞蓟宾和异水飞蓟宾。副产物的深入加工，可以大大提高该水飞蓟宾精制工艺的综合收益。
　　 (5)开展了对水飞蓟提取物及其单体化合物的体外抗氧化和酪氨酸酶抑制作用研究
　　 测定了不同提取方法得到的提取物的体外抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性。结果表明，不同提取物的活性具有显著的差异。其中，酶法提取得到的提取物的活性最高。通过各提取物活性成分的含量与活性之间的相关性分析还推出各个单体化合物对活性作用的贡献大小。
　　 全面比较了水飞蓟素、水飞蓟宾及其各单体化合物的体外DPPH·清除活性和酪氨酸酶抑制活性。与相关性分析得出的活性顺序一致。结果表明，对映体的单体化合物的活性及对映体混合物的活性有明显差异，且水飞蓟宾A、B的DPPH清除活性略高于水飞蓟宾。水飞蓟宾B酪氨酸酶抑制活性分别约为槲皮素4倍和水飞蓟素9倍。水飞蓟宾对映体酪氨酸酶抑制活性亦有明显差异。水飞蓟宾B的酪氨酸酶抑制活性大约为水飞蓟宾2倍，而水飞蓟宾A的酪氨酸酶抑制活性略低于水飞蓟宾1倍。水飞蓟宾B可以作为一种新的天然来源的酪氨酸酶抑制剂。
　　 以上研究为人们合理利用水飞蓟资源提供了可靠的理论依据和技术支撑。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章　文献综述

1.1引言

1.2水飞蓟的研究进展

1.2.1水飞蓟研究的文献分析

1.2.2化学成分概述

1.2.3水飞蓟的药理研究

1.2.4水飞蓟宾提取工艺研究

1.2.5水飞蓟油提取工艺研究

1.2.6水飞蓟主要有效成分的分析测定方法

1.2.7水飞蓟有效成分分离工艺研究

1.3酶法提取技术在植物有效成分提取中的应用

1.4分离纯化新技术

1.4.1高速逆流色谱分离法

1.4.2制备高效液相色谱分离

1.5水飞蓟研究存在的主要问题

1.6本研究的内容与创新

1.6.1本研究的内容

1.6.2本研究的创新之处

第二章　高效液相色谱法测定水飞蓟提取物中的活性成分

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1试剂与材料

2.2.2仪器

2.2.3样品的制备

2.2.4标准溶液的配制

2.2.5改进的高效液相色谱条件

2.2.6一种新的快速的UPLC色谱条件

2.2.7检出限、精密度与回收率的测定

2.3结果与讨论

2.3.1 UV波长的选择

2.3.2 HPLC条件的优化

2.3.3 UPLC条件的优化

2.3.4检出限与线性关系

2.3.5精密度与回收率的测定

2.3.6实际样品的测定

2.4 UPLC方法和HPLC方法的比较

2.4.1分析时间和分离度方面的比较

2.4.2流动相消耗量的比较

2.5本章小结

第三章　酶法辅助提取水飞蓟宾

3.1引言

3.2实验材料与方法

3.2.1试剂与材料

3.2.2仪器

3.2.3乙醇回流、超声、微波和酶法辅助提取水飞蓟宾

3.2.4 HPLC法测定水飞蓟宾的含量

3.3结果与讨论

3.3.1正交实验优化超声辅助提取的条件

3.3.2正交实验优化微波辅助提取的条件

3.3.3正交实验优化酶法辅助提取的条件

3.3.4响应面法优化水飞蓟宾酶法提取条件

3.3.5不同提取方法得到水飞蓟提取物的比较

第四章　制备色谱分离纯化水飞蓟主要活性成分及其结构鉴定

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1试剂与材料

4.2.2仪器

4.2.3电喷雾电离串联质谱法(ESI-MS-MS)的液相-质谱仪器条件

4.2.4超高效液相色谱-飞行时间质谱法(UPLC-TOF-MS)仪器条件

4.2.5样品的制备

4.2.6响应面法优化制备色谱分离水飞蓟宾对映体的操作参数

4.2.7水飞蓟素结晶母液为原料制备分离纯化活性成分的制备色谱条件

4.3结果与讨论

4.3.1制备分离水飞蓟宾对映体的响应面优化方案及结果

4.3.2响应面模的验证

4.3.3水飞蓟素结晶母液为原料制备色谱分离纯化活性成分

4.3.4化合物单体的结构鉴定

4.4本章小结

第五章　高速逆流色谱法分离纯化水飞蓟提取物中的活性成分

5.1引言

5.2实验部分

5.2.1试剂与材料

5.2.2仪器

5.2.3分配系数的测定

5.2.4溶剂体系及样品溶液的配制

5.2.5分析逆流优化溶剂体系

5.2.6制备逆流分离

5.2.7 HPLC分析

5.3结果与讨论

5.3.1水飞蓟提取物对映体分离的溶剂系统的选择及分析逆流优化溶剂体系

5.3.2水飞蓟提取物对映体分离逆流系统中手性试剂的选择及优化

5.3.3逆流色谱制备水飞蓟提取物对映体单体

5.3.4高速逆流色谱分离纯化水飞蓟宾结晶母液中的花旗松素、水飞蓟宁和水飞蓟亭的溶剂体系的选择

5.3.5水飞蓟宾结晶母液中花旗松素、水飞蓟宁和水飞蓟亭分析逆流优化溶剂体系

5.3.6制备逆流制备花旗松素、水飞蓟宁和水飞蓟亭

5.3.7制备逆流制备与制备液相的比较

5.4本章小结

第六章　水飞蓟有效成分体外抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性

6.1引言

6.2实验部分

6.2.1试剂与材料

6.2.2仪器

6.2.3清除O22-·的测定方法

6.2.4清除DPPH·的测定方法

6.2.5清除·OH的测定方法

6.2.6酪氨酸酶抑制活性的测定方法

6.2.7总黄酮含量的测定

6.2.8统计分析

6.3结果与讨论

6.3.1不同提取方法得到的水飞蓟提取物的DPPH·清除作用

6.3.2不同提取方法得到的水飞蓟提取物对超氧自由基的清除作用

6.3.3不同提取方法得到的水飞蓟提取物对羟基的清除作用

6.3.4不同提取方法得到的水飞蓟提取物的酪氨酸酶的抑制作用

6.3.5水飞蓟提取物中各化合物单体与活性之间的相关性研究

6.3.6水飞蓟提取物分离得到的主要单体化合物的DPPH·清除活性

6.3.7水飞蓟提取物分离得到的主要单体化合物的酪氨酸酶抑制活性

6.4本章小结

第七章　结论与展望

7.1主要结论

7.2建议和展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

附录