酿酒酵母响应短期乙醇协迫的应激机制的代谢组学研究

摘要

自工业革命以后，人类商品种类迅速丰富，从而对能源的需求量迅速增长。寻找可再生的清洁能源，是目前发展状况下的一件非常重要的事。利用酵母发酵产乙醇是一个较为经济而且环保的生产可再生能源的方式;但还是存在一定的局限性。随着发酵过程中乙醇的累积，酿酒酵母受到的毒害也越来越严重，渐渐地，细胞本身及其各细胞器形态和功能都会发生变化，当乙醇浓度累积到一定程度的时候，超过酵母的耐受极限，酵母就会死亡。所以，了解酿酒酵母响应乙醇胁迫的应激机制尤为重要。
　　 首先，本文从酿酒酵母的生理情况入手，测得其生长的阶段，再利用化学法监测培养基中累积到的乙醇含量。二者结合，选择进行乙醇胁迫的时间点，用不同浓度的乙醇(0％、3％、6％、9％、12％、15％)浸泡胁迫酵母细胞，测定其受到胁迫之后的衰以及细胞大小。发现实验用菌种稳定期很长，并伴有缓慢的二次生长，几乎看不到衰亡期。确定胁迫时间为对数生长期中的8小时。发现死亡率不是随着乙醇浓度的增大而线性增长，而是在达到一定浓度之后突然增加。随着乙醇浓度的升高，经过胁迫后的细胞大小也逐渐发生变化，越来越小。
　　 其次，利用基于气相色谱-质谱联用的代谢组分析平台，分析不同浓度胁迫后的胞内代谢物。利用主成分分析( PCA，principal component analysis)和偏最小二乘法(PLS，partial least squares)提取六组代谢物中的差异成分鉴定出了22种差异代谢物。
　　 最后，利用聚类分析衡量不同数据源间的相似性，用代谢的差异表达分析将这些差异物质整合到酿酒酵母的代谢途径中进行分析表明氨基酸和不饱和脂肪酸在酿酒酵母响应乙醇胁迫的反应中起着正面的作用，另外，由于能够产生肌醇的突变体存活率较高，酵母在受到高浓度乙醇(12％、15％)刺激后可能出现了能产生肌醇的突变体。
　　 本研究运用代谢组学这一方法以及代谢途径分析，从不同角度分析酵母在乙醇胁迫后的应激机制。为日后的研究提供了理论基础。

目录

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摘要

第一章 绪论

1．1 课题背景

1．2 酿酒酵母的乙醇耐受机制

1．2．1 酿酒酵母受到乙醇胁迫产生的生理影响

1．2．2 酿酒酵母耐乙醇分子机制

1．3 代谢组学研究进展

1．3．1 代谢组学的发展

1．3．2 代谢组学研究方法

1．3．3 代谢组学的分析技术

1．3．4 代谢组学技术的应用

1．4 本课题的研究意义和内容

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究内容

第二章 酿酒酵母生长受到不同浓度乙醇浸泡的影响

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器设备

2．2．1 菌种与试剂

2．2．2 实验器材

2．3 实验方法

2．3．1 胁迫取样时间确定

2．3．2 培养液中乙醇浓度监测

2．3．3 测量不同浓度乙醇胁迫对酿酒酵母死亡率的影响

2．3．4 测量细胞大小

2．4 实验结果

2．4．1 胁迫取样时间确定

2．4．2 培养液中乙醇浓度监测

2．4．3 不同浓度乙醇胁迫对酿酒酵母死亡率的影响

2．4．4 受到乙醇胁迫后细胞大小

2．5 本章小结

第三章 乙醇胁迫后酿酒酵母代谢物差异的代谢组学分析

3．1 前言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．3．1 细胞培养

3．3．2 淬灭,提取细胞菌体

3．3．3 细胞内物质的提取

3．3．4 蒸发溶剂

3．3．5 衍生

3．3．6 GC-MS

3．3．7 数据处理

3．4 实验结果

3．4．1 不同浓度乙醇浸泡胁迫后的酿酒酵母代谢物比较

3．4．2 各个浓度乙醇浸泡胁迫组与未加乙醇的对照组比较

3．5 小结

第四章 代谢物的聚类分析以及代谢途径分析

4．1 前言

4．2 实验方法

4．2．1 聚类分析

4．2．2 代谢的差异表达分析

4．3 实验结果

4．3．1 聚类分析

4．3．2 代谢的差异分析

4．4 小结

第五章 实验结论与展望

5．1 结论

5．2 论文的创新之处

5．3 展望

参考文献

附录一

附录二

附录三

致谢

作者及导师简介

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