大肠杆菌核糖体RNA甲基化酶RlM与RsmI的结构和功能研究

摘要

核糖体RNA分子上的甲基化修饰是常见修饰类型之一，在原核生物中最为普遍，在真核生物中也少量存在。细菌核糖体RNA的甲基化，对调节转录后RNA的功能和抗生素抗药性机制的产生非常重要，这些修饰位点在不同菌种间是比较保守的，而且这些位点一般都位于成熟核糖体中最保守的重要功能区。因此，对核糖体RNA的甲基化过程中不同的甲基转移酶如何与S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)结合并识别RNA分子上的碱基特异位点的研究将有助于深入理解这一过程在调节原核生物和真核生物DNA转录后的修饰和蛋白质合成过程的重要作用，也为进一步开发更有效的抗生素药物提供基础数据。
　　 RlmM(rRNA large subunit methyltransferase M)与RsmI(rRNAsmall subunit methyltransferase I)是存在于E.coli中的两个甲基化酶，分别由基因rlmM(ygdE)与rsmI编码，RlmM是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的甲基化酶，负责催化23S rRNA肽酰转移酶区域2498位胞嘧啶(C2498)的2'-O-甲基化;RsmI负责与mRNA的P位点密码子直接相互作用的16S rRNA的1402位胞嘧啶(C1402)的2'-O-甲基化。目前在国内外，关于上述两个甲基化酶的结构、与底物的作用方式的研究少之甚少，为了揭开其三维结构的面纱并对其作用机制进行进一步研究，本课题针对RlmM与RsmI这两个酶展开了深入的研究。
　　 首先对于RlmM，将其在E.coli中进行诱导表达并纯化后得到较为纯净的蛋白，该蛋白在低盐条件下很不稳定，无法进行下一步实验。经二级结构预测分析，构建了RlmM的三个截短体，分别截去其N段的7个、11个和12个氨基酸，经表达纯化分析，发现将N端的柔性区域全部截去（12个氨基酸）获得的截短体RlmM1-354经纯化后获得的蛋白最为稳定。将该截短体及其与辅助因子的复合物分别进行结晶条件的筛选与优化，均得到质量较好的块状和菱形晶体。经X-射线衍射分析，前者得到分辨率为3.4(A)的衍射数据，后者的共结晶产物得到2.3(A)的高分辨率数据，但经结构分析未发现底物S-AdoMet的存在。将收集的X-射线衍射数据进行解析后发现RlmM1-354是由一个N端负责结合底物RNA的THUMP结构域和一个C端起催化功能的具有Rossman折叠结构的甲基转移酶结构域组成，两个结构域之间由包含310helix的一段很长的loop区连接，该结构的解析为进一步深入的研究其功能的发生、与底物以及作用靶位点的结合区域以及结合方式提供了可靠数据。
　　 将RsmI构建到pET21a载体中，在E.coli中进行诱导表达，经Ni柱亲和层析和Superdex200凝胶过滤层析纯化后得到较纯净的样品。在纯化过程中发现，该蛋白对于温度的变化很敏感，在0℃很容易沉淀，而在4至10℃处于较稳定的状态，此后将蛋白进行浓缩至一定浓度后，在20℃恒温室中进行结晶条件的筛选和优化，得到棒状和菱形的晶体，经X-射线衍射分析，其分辨率在5～7(A)左右，后续优化实验仍在进行中。

目录

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学位论文数据集

摘要

第一章 绪论

1．1 大肠杆菌甲基转移酶RlmM与RsmI的简介

1．1．1 大肠杆菌23S rRNA C2498甲基化酶RlmM简介

1．1．2 大肠杆菌16S rRNA C1402甲基化酶RsmI简介

1．2 蛋白的晶体学理论

1．2．1 蛋白晶体学简介

1．2．2 蛋白结晶原理及方法简介

1．2．3 影响晶体形成的因素

1．2．4 衍射数据的收集与处理

1．2．5 蛋白的纯化方法

1．2．6 本文研究目的及意义

第二章 rlmM的克隆、表达及蛋白纯化

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 主要试剂及工具酶

2．2 试验方法

2．2．1 rlmM基因的克隆及重组质粒的构建

2．2．2 RlmM1-354的表达

2．2．3 RlmM1-354的纯化

2．3 结果与讨论

2．3．1 rlmM基因PCR扩增产物电泳检测结果

2．3．2 重组质粒pET28at-plus-rlmM PCR鉴定

2．3．3 测序结果

2．3．4 Ni柱亲和层析纯化结果

2．3．5 Heparin离子交换层析结果

2．3．6 Superdex200凝胶过滤层析纯化结果

2．4 本章小结

第三章 Rlm1-354的晶体筛选、优化以及X-射线数据的收集及结构解析

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 晶体的筛选

3．2．2 衍射数据的收集

3．2．3 数据的处理与蛋白模型构建

3．3 结果与讨论

3．3．1 蛋白浓度的测定

3．3．2 RlmM1-354、RlmM1-354与其底物S-AdoMet(SAM)复合物晶体的初筛

3．3．3 晶体的优化

3．3．4 数据的收集

3．3．5 数据的处理及结构分析

3．4 本章小结

第四章 rsmI的克隆、表达与蛋白纯化

4．1 实验材料

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 主要试剂及工具酶

4．2 实验方法

4．2．1 rsmI的克隆

4．2．2 pET21a-rsmI的表达

4．2．3 RsmI的纯化

4．2．4 RsmI在溶液中聚集状态的确定

4．3 结果与讨论

4．3．1 rsmI基因的克隆

4．3．2 重组质粒pET21a-rsmIPCR鉴定

4．3．3 测序结果

4．3．4 RsmI的Ni柱亲和层析纯化结果

4．3．5 RsmI分子筛Superdex200凝胶层析

4．3．6 RsmI在溶液中聚集状态的确定

4．4 本章小结

第五章 RsmI结晶条件的筛选与优化及初步X-射线衍射分析

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．2．1 蛋白浓度的测定

5．2．2 RsmI与复合物RsmI-SAM以及RsmI-SAM-cytidin结晶条件的初步筛选

5．2．3 RsmI与复合物RsmI-SAM以及RsmI-SAM-cytidin结晶条件的优化

5．3 晶体的X-射线衍射

5．4 结果与讨论

5．4．1 蛋白浓度的测定

5．4．2 RsmI与复合物RsmI-SAM以及RsmI-SAM-cytidin结晶条件的初步筛选

5．4．3 RsmI结晶条件的优化

5．5 晶体的X-射线衍射

第六章 结论

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

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