大肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因rmtB缺失株的构建及其耐药性分析

摘要

为探索大肠杆菌(E.coli) 16S rRNA甲基化酶耐药基因rmtB在菌体形成氨基糖苷类抗生素抗性中的作用,本研究以rmtB阳性菌E.coli 3A11-16作为亲本株,经PCR扩增其上下游序列作同源臂序列,分别克隆于pBluescript Ⅱ KS+中,构建pBlue-△rmtB,其rmtB基因中缺失的30bp由质粒中多克隆位点的18bp替换,以Xba Ⅰ/Kpn Ⅰ酶切pBlue-△mtB,目的片段亚克隆于自杀性载体pDMS197中,构建pDMS-△rmtB,电转化至野生菌E.coli3Al1-16,筛选获得rmtB基因缺失株E.coli 3A11-16△rmtB.同时将rmtB基因插入pBR322中转化于基因缺失株构建其回补株.微量稀释法分别测定rmtB亲本株、基因缺失株和回补株对氨基糖苷类抗生素的耐药性.PCR和测序结果显示rmtB基因缺失株构建正确,证明通过自杀性载体能够对质粒中的基因进行改造.药敏试验显示相对于亲本株,基因缺失株对4,6-二脱氧链霉胺类氨基糖苷抗生素耐药性降低至质控菌水平,表明16S rRNA甲基化酶rmtB基因是介导大肠杆菌对4,6-二脱氧链霉胺类氨基糖苷类抗生素高度耐药的重要基因.本实验通过构建rmtB基因缺失株,为进一步研究rmtB阳性菌生物学功能及其在E.coli中的耐药机制奠定了基础.