β-半乳糖苷酶和酪氨酸酶荧光探针的合成及应用研究

摘要

研究快速检测食品中各成分的方法,对食品安全检测的发展具有重大意义。与传统的检测方法,如气相色谱-质谱联用法、电化学分析法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等相比,荧光探针具有操作简便、选择性强、灵敏度高、特异性识别以及原位检测等优势,现已成为有机化学、分析化学和生物医学的交叉热点。本论文以食品中β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶为研究对象,分别设计了2个比率型、2个荧光增强型可视化荧光探针,具体如下:1.以β-半乳糖苷键为识别基团,设计合成了2个比率型β-半乳糖苷酶荧光探针:1)以7-羟基-4-甲基香豆素为荧光基团制备荧光探针P1。荧光探针P1可在水中定量检测β-半乳糖苷酶(β-gal)。随着β-gal酶活性的增加,探针P1在发射峰374 nm处荧光强度下降,444 nm处荧光强度升高,响应时间为30 min。在365 nm紫外灯下可观察到,随着β-gal酶活性的逐渐增加,溶液颜色由无色逐渐变为蓝色。探针P1在I 444 nm/I 374nm处荧光强度比值与β-gal酶活性具有良好的线性相关,检测限为0.0054 U/m L。此外,应用该方法检测到成熟猕猴桃汁中β-gal酶活性为0.0938±0.0027 U/m L;2)以苯并噻吩-萘为荧光基团,β-半乳糖苷键为识别基团设计、合成比率型荧光探针P2,该探针的检测体系为水。随着β-gal酶活性的增加,探针P2在发射峰505 nm处的荧光强度升高,407 nm处的荧光强度下降,响应时间为45 min。与探针P1相比,探针P2随着β-gal酶活性逐渐增加颜色变化更明显,在紫外365 nm光源下观察到溶液由蓝色逐渐变为黄绿色。探针P2在I 407 nm/I 505 nm处的荧光强度比值变化可实现对β-gal酶活性的定量检测,检测限为0.0250 U/m L,定量限为0.0840 U/m L,并成功检测到成熟木瓜汁中β-gal酶活性为2.0033±0.0892 U/m L。拍照,利用手机免费软件取色器APP,读取溶液照片的RGB值。溶液照片的G值与β-gal酶活性呈线性相关,将成熟木瓜汁加入到探针溶液中,拍照读取照片的G值,可计算出成熟木瓜汁中β-gal活性为2.3726 U/m L,与探针P2荧光光谱法、β-半乳糖苷酶分光光度法检测结果一致。结果表明,以探针P2作为检测工具,无需使用任何专业设备,即可实现对水果中β-gal酶活性的测定,探针P2具有较好的应用前景。2.以3-羟基苯基为识别基团,设计合成了2个荧光增强型酪氨酸酶荧光探针。1)以二苯并噻唑为荧光基团制备荧光探针P3。探针P3可在缓冲溶液(p H7.4)中,定量检测低活性Tyr。向探针P3溶液中加入Tyr后,540 nm处荧光强度升高,同时可在紫外365 nm光源下观察到溶液颜色由浅黄色逐渐变为亮黄色。探针P3在540 nm处荧光强度变化与Tyr酶活性具有良好的线性相关,检测限为0.2300 U/m L。此外,应用该方法检测到马铃薯提取液中Tyr酶活性为4.6281±0.0453 U/m L。拍照,利用手机免费软件取色器APP,读取溶液照片的RGB值。溶液照片的R、G值与Tyr酶活性呈线性相关,将马铃薯提取液加入到探针溶液中。由于马铃薯提取液具有背景颜色干扰G值,因此拍照读取照片的R值,可计算出马铃薯提取液中Tyr酶活性为4.2348 U/m L,与探针P3荧光光谱法检测结果一致;2)以苯并噻吩-萘为荧光基团,3-羟基苯基为识别位点制备荧光增强型探针P4。随着不同酶活性Tyr的加入,在365 nm紫外灯下可观察到溶液颜色由无色逐渐变为亮黄色。探针P4在505 nm处荧光强度变化与Tyr酶活性具有良好的线性相关,检出限为20.81295 U/m L。并成功检测到河北老树雪梨中Tyr酶活性为233.8554±7.2609 U/m L。与手机免费软件取色器APP,读取溶液照片的RGB值,溶液照片的R、G值与Tyr酶活性呈线性相关,将河北老树雪梨汁加入到探针溶液中。拍照读取照片的R值、G值,可计算出马铃薯提取液中Tyr酶活性为267.0504 U/m L、294.0206 U/m L,与探针P4荧光光谱法检测结果一致;结果表明,探针P4可作为检测Tyr酶活性工具,具有良好的应用前景。本论文共设计合成4个新型可视化荧光探针,并对其实际应用价值进行了研究,为食品中β-半乳糖苷酶和酪氨酸酶的快速检测研究提供了新的参考。

目录

摘要

abstract

第1章 绪论

1.1 引言

1.2 荧光分析法的原理

1.2.1 荧光产生原理

1.2.2 荧光探针的结构

1.2.3 荧光探针的识别机理

1.3 荧光探针研究现状

1.3.1 β-半乳糖苷酶荧光探针

1.3.2 酪氨酸酶荧光探针

1.4 本论文的选题思路和研究内容

第2章 β-半乳糖苷酶荧光探针的合成及应用研究

2.1 引言

2.2 以7-羟基-4-甲基香豆素为荧光基团的β-gal的荧光探针

2.2.1 荧光探针P1的设计

2.2.2 实验部分

2.2.3 结果与讨论

2.3 以苯并噻吩-萘为荧光基团的β-gal的荧光探针

2.3.1 荧光探针P2的设计

2.3.2 实验部分

2.3.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 酪氨酸酶荧光探针的合成及应用研究

3.1 引言

3.2 以二苯并噻唑为荧光基团的Tyr荧光探针

3.2.1 荧光探针P3的设计

3.2.2 实验部分

3.2.3 结果与讨论

3.3 以苯并噻吩-萘为荧光基团的Tyr荧光探针

3.3.1 荧光探针P4的设计

3.3.2 实验部分

3.3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 总结与展望

4.1 总结

4.2 展望

参考文献

在学期间发表的论文及科研成果

致谢