MicroRNA-154-5p靶向Cullin2在宫颈癌发生发展中的作用及其机制研究

摘要

目的：　　探讨microRNA-154-5p（miR-154-5p）靶向Cullin2（CUL2）在宫颈癌中的作用及其机制，为宫颈癌的发生提供新的生物标志物。　　方法：　　1.实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitativereal-timepolymerasechainreaction,RT-qPCR）检测宫颈癌组织和细胞中miR-154-5p的表达情况；通过免疫组织化学和RT-qPCR分别检测CUL2蛋白和mRNA在宫颈癌组织和细胞中的表达。　　2.双荧光素酶报告分析实验明确miR-154-5p与CUL2之间的靶向调控位点。　　3.利用慢病毒载体介导的重组DNA技术构建稳定高、低表达miR-154-5p的SiHa细胞模型，分别命名为miR-154-5p过表达（Lv-miR-154-5p-Overexpression,Lv-miR-154-5p-OE）组和miR-154-5p沉默（Lv-miR-154-5p-Sponge,Lv-miR-154-5p-Sp）组。RT-qPCR及Westernblot检测差异表达miR-154-5p对其下游CUL2的影响，同时通过CCK-8、平板克隆形成实验、细胞周期实验、划痕实验及Transwell分别测定并评估SiHa细胞的增殖、集落形成、细胞周期分布、迁移和侵袭能力。　　4.构建CUL2过表达慢病毒载体，包装后感染Lv-miR-154-5p-OE组的SiHa细胞，获得miR-154-5p和CUL2同时过表达的稳定细胞株。RT-qPCR、Westernblot验证构建效果后实施功能回复实验，进一步确定miR-154-5p与CUL2之间的调控关系。　　结果：　　1.与正常宫颈组织和HaCaT相比，miR-154-5p在宫颈癌组织和SiHa细胞中的表达均下调（P＜0.05；P＜0.01）；而CUL2的表达则上调（P＜0.01；P＜0.01）。　　2.双荧光素酶报告分析实验证实，CUL2为miR-154-5p的直接靶点（P＜0.001）。　　3.成功获得稳定高、低表达miR-154-5p的SiHa细胞株，RT-qPCR结果证实，miR-154-5p在Lv-miR-154-5p-OE组中被升高（P＜0.01）；而在Lv-miR-154-5p-Sp组中被下调（P＜0.05）。Lv-miR-154-5p-OE组较对照组CUL2mRNA和蛋白的表达水平下调（P＜0.001；P＜0.05），且细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力弱，处于G1期的细胞比例高（P＜0.05；P＜0.001；P＜0.01；P＜0.01；P＜0.01）。而Lv-miR-154-5p-Sp组则可使CUL2mRNA和蛋白的表达水平升高（P＜0.001；P＜0.05），细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力增强，处于G1期的细胞比例下降（P＜0.05；P＜0.001；P＜0.001；P＜0.001；P＜0.001）。　　4.功能回复实验结果表明，与对照组相比，过表达组中CUL2mRNA和蛋白水平均升高（P＜0.05；P＜0.05），SiHa细胞的增殖、集落形成和迁移能力增强（P＜0.01；P＜0.001；P＜0.05），G1期的细胞分布减少（P＜0.001）。　　结论：　　1.宫颈癌的发生与miR-154-5p低表达及CUL2高表达有关。　　2.MiR-154-5p通过下调CUL2的表达抑制宫颈癌细胞的恶性生物学行为。

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