基于肠粘膜共生菌移位研究铁皮石斛多糖免疫调节与肠道益生功能的联系

摘要

铁皮石斛（DendrobiumoffcinaleKimuraetMigo）是一种名贵药食两用植物，多糖是其主要活性成分之一。本研究使用的铁皮石斛多糖(DOP)是一种具有高度乙酰化修饰的天然葡甘露聚糖。团队前期研究证明了DOP对免疫抑制小鼠的保护作用和对健康小鼠的肠道益生功能。在此基础上，本研究进一步探究DOP的免疫调节活性和肠道益生功能之间的联系。本文首先在免疫抑制小鼠中，借助高通量测序技术与基因组学分析手段，比较了3种不同主链结构的植物多糖(葡甘露聚糖DOP，木聚糖xylan和果聚糖inulin)对小鼠肠道菌群空间分布，外周免疫器官中移位细菌和免疫功能的影响，提出DOP通过影响粘膜共生细菌移位至外周免疫器官发挥免疫调节功能的机制，即“肠道共生细菌移位-免疫调节”假设，继而通过3种不同配方的抗生素干扰肠道菌群结构和功能进行验证，最后在脂多糖炎症小鼠中进一步验证该假设。本实验主要研究内容和结果如下:　　(1)在环磷酰胺(CTX)诱导的免疫抑制小鼠中，通过广谱抗生素(ATB)清除肠道菌群发现脾脏中细菌负荷量和脾脏指数显著降低，结果说明免疫抑制小鼠脾脏指数的改变可能与肠道共生细菌移位至脾脏有关。同时考察了连续灌胃2周低、中、高剂量的DOP对免疫抑制小鼠脾脏免疫反应和肠道短链脂肪酸(SCFA)合成的影响。结果表明高剂量的DOP(DOP-H)显著增加脾脏指数，显著促进脾脏pTh17免疫反应，以及显著增加与细菌移位相关的Rorγt的表达。在粪便SCFA合成上，DOP-H显著增加粪便乙酸的合成，降低盲肠中支链脂肪酸(BCFA)的合成，以及改善肠黏膜损伤，保护肠道健康。以上结果表明DOP的肠道益生作用可能通过影响肠道共生细菌移位至脾脏，进而增加免疫抑制小鼠脾脏指数和诱导与细菌移位相关的Th17型免疫反应。　　(2)研究比较了DOP，xylan和inulin对免疫抑制小鼠肠道SCFA合成和肠内肠外微生态结构的影响。结果表明，与正常小鼠相比，灌胃2周DOP，xylan和inulin均能促进粪便中丁酸合成，且DOP具有显著促进作用。与免疫抑制小鼠相比，xylan和inulin显著抑制盲肠丁酸的合成，而DOP对盲肠丁酸合成无明显影响。在肠内微生态结构上，xylan和inulin干预显著改变结肠内容物和结肠组织中优势菌科的数量，而DOP干预对大部分优势菌科如紫单孢菌科（Porphyromonadaceae），拟杆菌科（Bacteroidaceae）毛螺菌科（Lachnospiraceae）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）的数量无明显影响。但DOP干预显著增加回肠粘膜菌群α多样性，从而增加肠内生态位上共有OTU的数目（占总OTU数中38.3％）;在回肠粘膜菌群组成上，DOP显著降低乳杆菌科（Lactobacillaceae）的数量，显著增加紫单孢菌科的数量。在免疫抑制小鼠肠外微生态结构上，DOP干预对脾脏和肠系膜淋巴结（MLN）中菌群结构无明显影响，但会增加脾脏微生物来源中回肠粘膜细菌的比例，以及降低结肠组织细菌的比例。结果说明，DOP干预对肠道丁酸合成和结肠菌群组成的调节，与xylan和inulin干预相比具有明显区别。同时与CTX相比，DOP通过改变回肠粘膜菌群结构，影响脾脏中的移位细菌的组成。　　(3)研究比较了DOP，xylan和inulin对免疫抑制小鼠肠内和肠外免疫反应的影响。T淋巴细胞分化平衡在维持机体免疫稳态中发挥重要作用。结果显示，DOP显著促进回肠T-bet和Rorγt的表达，从而增加T-bet/GATA-3和Rorγt/Foxp3的比值，而inulin和xylan显著促进结肠Rorγt的表达，但对结肠Rorγt/Foxp3的比值无显著影响。在脾脏和MLN中，DOP均显著增加Rorγt的表达和Rorγt/Foxp3的比值。说明DOP干预在免疫抑制小鼠回肠，MLN和脾脏中均诱导了与细菌移位相关的Th17型免疫反应。但在广谱抗生素(ATB)预处理小鼠中，DOP干预在回肠，MLN和脾脏中，以及xylan和inulin干预在结肠中，均无法有效诱导Th17型免疫反应，并且ATB预处理导致各组小鼠回肠粘膜菌群结构高度相似。因此，在ATB预处理小鼠中证实DOP通过影响回肠粘膜菌群移位至外周免疫器官诱导Th17型免疫反应，即“肠道共生细菌移位-免疫调节”假设。此外，ATB预处理后经自然恢复或者xylan和inulin干预均显著增加免疫抑制小鼠脾脏指数和回肠粘膜菌群α-多样性，线性回归分析表明免疫抑制小鼠脾脏指数与回肠粘膜菌群α-多样性指数呈显著正相关。　　(4)研究比较了3种不同配方抗生素（ATB，粘杆菌素Colistin和万古霉素Vancomycin）预处理对植物多糖调节肠道SCFA合成的影响。不同于ATB对肠道菌群成员的广泛清除，Colistin和Vancomycin分别特异性地清除肠道菌群中的革兰氏阴性菌（如拟杆菌门和变形菌门）和革兰氏阳性菌（如厚壁菌门和放线菌门）。结果发现3种抗生素预处理结束后，肠道丁酸合成能力显著降低，且ATB的抑制作用最强。植物多糖干预后，xylan和inulin可以缓解Vancomycin预处理对盲肠丁酸合成的抑制，但无法改善ATB对盲肠丁酸合成的抑制，而DOP对Vancomycin和ATB预处理导致的盲肠丁酸降低均无缓解作用。在T淋巴细胞分化平衡上，Colistin和Vancomycin预处理小鼠经DOP干预后在回肠T-bet和Rorγt的表达，以及T-bet/GATA-3和Rorγt/Foxp3的比值上存在显著差异，但在脾脏和MLN中Rorγt的表达上无显著差异。结果说明DOP在免疫抑制小鼠中诱导与细菌移位相关的Th17型免疫反应可能依赖于肠道中产丁酸菌的存在。同时回肠粘膜菌群差异物种分析和相关性分析表明DOP可能通过促进Muribaculumsp.等移位至回肠粘膜，以及促进Parabacteroidesgoldsteinii和Bacteroidesthetaiotaomicron移位至外周免疫器官引起Th17型免疫反应。　　(5)最后，在脂多糖(LPS)诱导的炎症小鼠中进一步对“肠道共生细菌移位-免疫调节”假设进行验证。”研究报道炎症小鼠经单次灌胃10mg/ginulin和fructo-oligosaccharides(FOS)，可以在不改变结肠菌群结构的情况下，显著抑制LPS诱导的回肠炎症反应，并结合体外细胞培养研究结果总结认为果聚糖可直接发挥抗炎作用，而不依赖于对肠道菌群的作用。本研究通过重复该动物实验，发现单次灌胃高剂量的果聚糖显著增加盲肠中乙酸和丙酸的合成，增加脾脏和MLN细菌负荷量。结果说明单次灌胃高剂量果聚糖的抗炎作用可能涉及对肠道菌群的影响，同时炎症小鼠模型也会发生肠道细菌移位至外周免疫器官。此外，连续2周160mg/kg的DOP干预显著促进炎症小鼠的脾脏指数增加，抑制脾脏细菌负荷量，调节回肠粘膜菌群的组成，以及显著促进脾脏和MLN中RORγt的表达，结果说明，DOP可能通过改变炎症小鼠回肠粘膜菌群结构影响肠道共生细菌移位至外周免疫器官，并影响肠粘膜和系统炎症反应。　　综上所述，在CTX诱导的免疫抑制小鼠和LPS诱导的炎症小鼠中，DOP均通过调节回肠粘膜菌群结构来影响肠道共生细菌移位至外周免疫器官，进而调节肠粘膜和系统免疫反应，即“肠道共生细菌移位-免疫调节”的免疫调节机制。

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