阪崎肠杆菌生物膜形成影响因素及甲苯胺蓝O光动力灭菌作用研究

摘要

阪崎肠杆菌(又叫阪崎克罗诺杆菌，Cronobactersakazakii,C.sakazakii)主要存在于食品如蔬菜、奶酪、肉和奶粉中，能够导致婴幼儿奶粉感染事件的发生。本文采用比浊法、平板计数法研究阪崎肠杆菌在玻璃表面生物膜形成影响因素及超声波对其去除作用效果；采用甲苯胺蓝O为光敏剂，运用响应面对阪崎肠杆菌生物膜的光动力灭菌技术条件进行优化；通过激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜直接观察光动力对阪崎肠杆菌生物膜细胞的损伤效果及形态变化；研究壳聚糖对阪崎肠杆菌生物膜形成的抑制作用及对光动力灭菌效果的影响。　　主要研究结果如下：　　1.培养条件可影响阪崎肠杆菌生物膜的形成。在37℃，pH7.5，盐度2.5%的条件下有利于阪崎肠杆菌生物膜的形成；CaCl2(0.50%)、MgCl2(1.50%)对阪崎肠杆菌生物膜形成具有明显促进作用；Cu2+(1.50%)、EDTA(2.5%)对阪崎肠杆菌生物膜形成具有抑制作用。　　2.超声波处理对阪崎肠杆菌生物膜去除作用效果显著。超声波处理能够使玻璃表面上附着的阪崎肠杆菌生物膜脱落，超声波处理初始温度30℃，时间14min条件下去除效果最好。激光共聚焦显微镜可直接观察到超声波处理后盖玻片上阪崎肠杆菌生物膜活菌数量变化，可证实和评价超声处理对玻璃表面阪崎肠杆菌生物膜的去除效果。　　3.甲苯胺蓝O介导的光动力灭菌技术对阪崎肠杆菌生物膜灭活作用效果显著。通过响应面曲线分析，筛选出优化的光动力灭菌条件为：孵育时间20.5min，TBO浓度56μg/mL，光照时间30.5min，活菌数Log10(CFU/cm2)的理论值为3.44。　　4.激光共聚焦显微镜能从菌的荧光颜色观察光动力对阪崎肠杆菌生物膜细胞的灭菌效果。当光照时间延长时，细胞表征出较多的红色荧光，表明灭活效果显著。扫描电子显微镜可显示出灭菌后细胞形态变化，使用响应面优化的条件对阪崎肠杆菌生物膜进行灭菌后，细胞内陷，且部分细胞会破损并有内容物溶出。　　5.壳聚糖对阪崎肠杆菌生物膜的形成具有明显的抑制作用。同时，壳聚糖对已成熟的生物膜具有一定的破坏作用。壳聚糖可以促进甲苯胺蓝O的渗透作用，增大灭菌效果。因此，将壳聚糖与光动力灭菌技术联用可能开发成一种能有效去除生物膜的灭菌技术，并应用于食品领域。　　综上，甲苯胺蓝O介导的光动力灭菌技术可有效控制阪崎肠杆菌生物膜，因此，光动力灭菌技术对食品安全尤其是乳制品加工安全具有潜在应用价值。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 光动力灭菌技术

1.1.1 光动力灭菌技术概述

1.1.2 光敏剂

1.1.3 光源

1.1.4 应用

1.2 生物膜

1.2.1 生物膜的形成

1.2.2 生物膜的耐药性

1.2.3 生物膜对食品工业的影响

1.2.4 生物膜的控制

1.3 阪崎肠杆菌

1.3.1 阪崎肠杆菌特性

1.3.2 阪崎肠杆菌的致病机制

1.3.3 阪崎肠杆菌的控制

1.3.4 阪崎肠杆菌与奶粉

1.3.5 全球报道的阪崎肠杆菌感染病例

1.4 研究的目的、意义和内容

1.4.1 研究目的

1.4.2 研究内容

1.4.3 研究意义

1.4.4 研究技术路线图

第二章 阪崎肠杆菌生物膜形成的影响因素及超声波去除作用*

2.1 材料与方法

2.1.1 菌种

2.1.2 材料及试剂

2.1.3 仪器与设备

2.1.4 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 温度与培养基初始pH对阪崎肠杆菌生物膜形成的影响

2.2.2 倒置显微镜观察37℃下不同pH生长条件下的生物膜

2.2.3 培养基成分对阪崎肠杆菌生物膜形成的影响

2.4 超声波法对玻璃表面阪崎肠杆菌生物膜去除作用的影响

2.4.1 超声初始温度对玻璃表面阪崎肠杆菌生物膜去除作用的影响

2.4.2 超声时间对玻璃表面阪崎肠杆菌生物膜去除作用的影响

2.4.3 激光共聚焦显微镜观察超声初始温度对玻璃表面阪崎肠杆菌生物膜脱落效果

2.4.4 激光共聚焦显微镜观察超声时间对玻璃表面阪崎肠杆菌生物膜脱落效果

2.4.5 超声波活菌计数法测定盖玻片上阪崎肠杆菌生物膜生长曲线

2.3 本章小结

第三章 甲苯胺蓝O对阪崎肠杆菌生物膜的光动力灭菌效果*

3.1 材料与方法

3.1.1 菌种

3.1.2 材料及试剂

3.1.3 仪器与设备

3.1.4 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 TBO-APDT对阪崎肠杆菌生物膜杀菌作用的单因素实验

3.2.2 响应曲面法分析 TBO-APDT 优化实验

3.3 本章小结

第四章 激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察光动力对阪崎肠杆菌生物膜的损伤作用

4.1 材料与方法

4.1.1 菌种

4.1.2 材料及试剂

4.1.3 仪器与设备

4.1.4 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 激光共聚焦显微镜观察光动力对阪崎肠杆菌生物膜的灭菌作用

4.2.2 扫描电子显微镜观察光动力对阪崎肠杆菌生物膜的灭菌作用

4.3 本章小结

第五章 壳聚糖-光动力灭菌技术联用对阪崎肠杆菌生物膜的影响

5.1 材料与方法

5.1.1 菌种

5.1.2 材料及试剂

5.1.3 仪器与设备

5.1.4 实验方法

5.2 结果与分析

5.2.1 不同浓度壳聚糖对阪崎肠杆菌生物膜生物量的影响

5.2.2 不同浓度壳聚糖对玻璃表面阪崎肠杆菌成熟生物膜清除作用

5.2.3 扫描电子显微镜观察壳聚糖对成熟的阪崎肠杆菌生物膜的影响

5.2.4 壳聚糖-光动力灭菌技术联用对阪崎肠杆菌生物膜的影响

5.3 本章小结

第六章 全文讨论

6.1 阪崎肠杆菌生物膜形成的影响因素

6.2 超声波对阪崎肠杆菌生物膜的去除作用

6.3 甲苯胺蓝O对阪崎肠杆菌生物膜的光动力灭菌效果

6.4 壳聚糖-光动力灭菌技术联用对阪崎肠杆菌生物膜的影响

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 创新点

7.3 展望

参考文献

附录(Appendix)

硕士在读期间发表的论文、作者及导师简介

致谢