产蛋白酶菌株的筛选鉴定、发酵工艺优化、酶学性质及罗非鱼皮应用

摘要

蛋白酶是主要的工业化用酶之一，在食品、医药和化妆品行业有着广泛的应用。蛋白酶在全球酶制剂市场中占据了60%的销售量。我国是水产品生产大国，但对鱼类的加工以及副产物的利用率较低，在生产加工过程中产生了50～70%的副产物，造成了资源的严重浪费，因此利用蛋白酶将鱼类副产物转化为高价值产物成为一项重要课题。　　本研究从养殖废水中筛选出一株高产蛋白酶菌株，对菌株进行了形态结构、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析，确定菌株的种属；产酶的发酵工艺优化，并对分离纯化后的蛋白酶进行了酶学性质研究，最后将菌株发酵鱼皮得到的活性肽与亚铁离子螯合制备亚铁螯合肽，提高鱼皮的附加值。研究结果如下：　　从养殖废水中筛选得到的菌株4-2具有较高的产蛋白酶能力，经鉴定该菌株为芽孢杆菌，命名为Bacillussp.4-2。　　通过单因素实验对菌株发酵进行优化，确定的最佳发酵条件为：碳源种类及浓度为玉米粉2%，氮源种类及浓度为明胶2.5%，培养基初始pH为3.0，装液量为30mL(250mL锥形瓶)，最佳种龄和接种量为12h和2%，培养温度为30℃。优化后酶活达到了850U/mL，比未优化前酶活提高了近4倍。　　对发酵后收集的上清液进行终浓度为60%的硫酸铵沉淀、用20mMpH6.8的磷酸缓冲液重溶和透析，再利用阳离子交换柱分离纯化，得到了分子量约为22kD的蛋白酶。对纯化后的蛋白酶进酶学性质研究结果表明，该酶最适反应温度为50℃，在40、50℃下具有良好的热稳定性；最适pH为9.0；5mM的Mg2+、Mn2+、K+对蛋白酶活有促进作用，Cu2+、Fe2+和Ag+会抑制酶的活性；该蛋白酶对SDS不具有耐受性，Tween80和TritonX-100对该酶具有促进作用；该酶对1.5%H2O2和30%甲苯有一定的耐受性，30%乙醇、丙酮和正丁醇抑制该酶活性。　　利用菌株4-2发酵鱼皮获得活性肽，将得到的活性肽与亚铁离子进行螯合，确定优化后的螯合条件为：硫酸亚铁浓度为50mg/mL，抗坏血酸浓度为0.05g/mL，pH为6.5，螯合时间和温度为40min和40℃。对获得的亚铁螯合肽进行紫外光谱、红外光谱扫描和荧光扫描进行表征。

目录

声明

1绪论

1.1蛋白酶简介

1.2蛋白酶的分类

1.2.1 按照蛋白酶的来源分类

1.2.2 按照蛋白酶的催化反应类型分类

1.2.3按照蛋白酶催化位点的特性分类

1.3丝氨酸蛋白酶

1.3.1 丝氨酸蛋白酶的分类

1.3.2 丝氨酸蛋白酶的结构与特异性

1.3.3丝氨酸蛋白酶的催化机制

1.4产蛋白酶菌株发酵工艺的优化

1.4.1 培养基组成

1.4.2 培养条件

1.4.3 培养方法

1.5蛋白酶的分离纯化和酶学性质研究

1.5.1 蛋白酶的分离纯化

1.5.2 蛋白酶的酶学性质研究

1.6 金属螯合肽

1.6.1 金属螯合肽的制备

1.6.2 金属螯合肽的表征

1.7.1 在饲料工业方面的应用

1.7.2 在日用化工品方面的应用

1.7.3 在环境保护方面的应用

1.7.4 在医药方面的应用

1.7.5 在食品加工方面的应用

1.7.6 在酿造工业方面的应用

1.8本课题的立题依据。研究内容及技术路线

1.8.1 立题依据

1.8.2 主要研究内容及技术路线

2 产蛋白酶菌株的筛选与鉴定

2.1.1 实验样品

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 培养基

2.1.5 实验试剂

2.2.1 菌株初筛

2.2.2 蛋白酶活测定方法

2.2.3 菌株复筛

2.2.4 菌株鉴定

2.3实验结果与分析

2.3.1 产蛋白酶菌株的筛选

2.3.2 亮氨酸和酪氨酸标准曲线的绘制

2.3.3 菌株鉴定结果

2.3.4 菌株生理生化鉴定结果

2.3.5 16S rDNA分子生物学鉴定

2.4 本章小结

3 产蛋白酶菌株发酵工艺优化

3.1.1 实验菌株

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器

3.1.4 培养基

3.1.5 实验试剂配制

3.2 测定方法

3.2.1 菌株4-2生长曲线的测定

3.2.2 蛋白酶酶活测定方法

3.2.3 发酵工艺的优化

3.3.1 菌株4-2的生长曲线

3.3.2 发酵工艺优化实验结果

3.4 本章小结

4 蛋白酶的分离纯化与酶学性质研究

4.1.1 菌株与培养基

4.1.2 实验试剂

4.1.3 实验仪器

4.1.4 实验试剂配制

4.2.1 蛋白酶的分离纯化

4.2.2 蛋白酶酶学性质研究

4.3实验结果与分析

4.3.1 蛋白酶的分离纯化

4.3.2 蛋白酶酶学性质研究

4.4 本章小结

5 罗非鱼皮酶解蛋白亚铁螯合肽的工艺优化及表征

5.1.1 实验菌株

5.1.2 实验试剂

5.1.3 实验仪器

5.2 实验方法

5.2.1 亚铁离子浓度标准曲线的测定

5.2.2 亚铁离子浓度测定

5.2.3甘氨酸浓度标准曲线的测定

5.2.4 甘氨酸浓度的测定

5.2.5 亚铁螯合肽的制备

5.2.6 螯合率的测定

5.2.7 亚铁螯合肽制备工艺的优化

5.2.7 亚铁螯合肽的表征

5.3.1 亚铁离子浓度标准曲线

5.3.2 甘氨酸标准曲线

5.3.3 甘氨酸浓度及蛋白含量的测定

5.3.4亚铁螯合肽制备工艺的优化

5.3.5 亚铁螯合肽的表征分析

5.4 本章小结

6 结论与展望

6.1.1 菌株的筛选与鉴定

6.1.2 产蛋白酶菌株发酵工艺优化

6.1.3 蛋白酶的分类纯化与酶学性质研究

6.1.4罗非鱼皮酶解蛋白亚铁螯合肽的工艺优化及表征

6.2 展望

参考文献

作者简历

致谢

学位论文数据集