Insm1对胸腺髓质上皮细胞Aire基因表达的调控作用研究

摘要

目的：　　Insm1(Insulinoma associated 1)是一个编码锌指蛋白的基因，目前认为Insm1是一个在神经内分泌细胞中特异性表达因子。我们发现，Insm1在小鼠胸腺髓质细胞中高表达，而且与Aire(Autoimmune regulator)表达具有高度的细胞重合度。Aire是调控胸腺髓质细胞限制性抗原表达从而调控自身免疫耐受的一个重要的转录因子，在人类和小鼠中，Aire基因突变导致多器官自身免疫不耐受。本课题拟探讨Insm1对Aire基因表达的调控作用，并为探讨Insm1突变调节免疫耐受建立胸腺移植小鼠模型。　　方法：　　(1)采用Insm1基因突变(Insm1lacz/lacz)小鼠，通过免疫荧光和qRT-PCR方法，分析Insm1的定位和对基因表达的调控作用。　　(2)分离E18.5Insm1突变小鼠胸腺，进行去淋巴细胞培养，构建裸鼠肾包膜下胸腺移植方法；通过流式分析和基因型鉴定等方法，评价方法的可靠性。　　结果：　　(1)Insm1在胸腺中的定位和表达：在E18.5胸腺髓质细胞中，Insm1蛋白位于细胞核和细胞质中。在E18.5和6周龄小鼠胸腺髓质细胞中，Insm1与Aire共表达。在E18.5小鼠胸腺中，Insm1与标记胸腺髓质细胞的krt5共表达。　　(2)Insm1对基因表达的调控作用：与Insm1+/lacz对照组相比，Insm1lacz/lacz突变小鼠胸腺中，Aire与Aire依赖的组织限制性抗原基因(TRAs)表达水平降低。　　(3)构建了去除淋巴细胞的Insm1突变体胸腺移植到裸鼠肾包膜下的方法。胸腺移植裸鼠的胸腺和外周血中有CD4、CD8阳性T淋巴细胞，而在未移植裸鼠外周血中未发现CD4、CD8阳性T淋巴细胞，显示移植胸腺发挥了淋巴细胞生成功能。并且在移植裸鼠外周血淋巴细胞中没有检测到移植物来源的基因表达，提示移植胸腺中成熟的淋巴细胞来自受体。

目录

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本文常用缩略词表

第一章 引言

1 自身免疫耐受机制介绍

2 Aire与自身免疫性疾病

3 Aire缺乏导致自身免疫耐受缺陷的分子机制

4 调控Aire基因表达的分子机制

5 研究的目的与意义

第二章 实验仪器、材料与方法

1 实验仪器

2 实验材料

2.1 实验动物

2.2 主要试剂

2.3主要试剂配制

3 实验方法

3.3.1 细胞RNA的提取

3.3.2反转录获取cDNA

3.3.3 Real Time PCR检测mRNA的表达量

3.4 构建E18.5 Insm1突变胸腺移植裸鼠模型

3.4.1 获取E18.5 Insm1突变胸腺

3.4.2培养移植胸腺

3.4.3建立裸鼠肾包膜下空间

3.4.4裸鼠移植E18.5胸腺

3.5 小鼠基因型鉴定

3.6.1 裸鼠组织解剖

3.6.2 石蜡固定包埋

1 Insm1在胸腺中的定位及表达

1.1 Insm1在胸腺髓质细胞中的核质定位

1.2 胸腺中Insm1和Aire共表达

1.3 Insm1在胸腺中表达

1.4 成年胸腺Insm1与胰岛素共表达

1.5胸腺中Insm1与krt5共定位

2 Insm1突变对基因表达的调控作用

2.1 Insm1突变Aire表达量降低

2.2 Insm1突变Aire依赖的TRAs表达水平降低

3 Insm1突变对自身免疫耐受的调控作用动物模型建立

3.1 E18.5 Insm1突变胸腺移植裸鼠模型构建

3.2 流式细胞术鉴定移植裸鼠淋巴细胞来源

3.3 移植后裸鼠免疫器官形态的改变初步分析

第四章 结论

第五章 讨论

第六章 展望

参考文献

致谢