TGFβRⅡ基因在EML4-ALK融合基因肺腺癌中的表达水平及其对肺腺癌H3122细胞生物学行为的影响

摘要

目的:目前，在中国肺癌是发病率和死亡率位居第一的恶性肿瘤。针对晚期的非小细胞肺癌（NSCLC）治疗，分子靶向治疗成为研究热点，其中以EML4-ALK融合基为靶点的靶向治疗尤其备受关注。另外，众多科学家研究发现一种新的抑癌基因TGFβRⅡ。大量研究表明，TGFβRⅡ与多数恶性肿瘤发生发展密切相关，有研究发现，TGFβRⅡ在肠癌、头颈癌等恶性肿瘤中表达异常增高，但也有研究发现TGFβRⅡ在胃癌、结直肠癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、宫颈癌等癌症中异常降低并促进癌症发展。TGFβRⅡ是TGF-β蛋白主要结合受体蛋白，在细胞增殖过程中发挥重要作用，可进一步使TGFβR1磷酸化激活TGFβR1上下游相关通路，调节机体细胞正常生长凋亡。当TGFβ信号通路异常，机体内发生多种癌症危险性将大大升高。TGFβRⅡ基因表达异常在直接影响TGFβ信号通路失调之外，还可影响Smad等信号通路、Smad信号通路在细胞内发挥重要的调节DNA转录功能，一旦受到影响，将激活或抑制某些基因表达从而影响细胞增殖凋亡。除此之外，TGFβRⅡ作用可能还与Ras信号通路有关。研究发现，Ras信号通路可能介导TGFβRⅡ表达下调，这是癌症进展的可能发生机制。另外，TGFβRⅡ表达还与某些非编码单链RNA分子（microRNA）表达有关，miR-370、miR-590-5p等可通过靶向下调TGFβRⅡ表达分别促进胃癌、肝癌肿瘤细胞增殖侵袭。另有研究发现，TGFβRⅡ信号通路在癌症早期可抑制肿瘤细胞增殖分化，而后期则会因各种原因减弱或失去癌症细胞增殖的抑制作用，并发生肿瘤细胞迁移的促进作用。另外，研究发现TGFβRⅡ表达异常促使肿瘤组织表现细胞的异常分化、细胞核扩大和大量有丝分裂、炎症和血管生成等特征。血管生成是肿瘤进展的重要病理特征，已有研究发现TGFβRⅡ在血管生成过程中扮演重要角色，其可以直接调节参与血管形成的效应分子的表达，与Smad4和Notch信号通路共同调节黏附分子N-cadherin的转录，影响内皮细胞及其周细胞的黏附作用，从而影响血管的成熟与稳定。多数研究表明癌症组织TGFβRⅡ表达与正常组织比较有明显差异，且TGFβRⅡ表达变化与癌症临床分期有显著统计学意义。我们通过筛选EML4-ALK融合基因表达阳性患者后，分析不同分期EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌患者临床特征，验证TGFβRⅡ在EML4-ALK融合基因阳性不同分期临床肺腺癌样本中的表达水平，以及TGFβRⅡ对肺腺癌H3122细胞生物学行为的影响，利用这些结果证明TGFβRⅡ对EML4-ALK融合基因表达阳性肺腺癌影响，了解TGFβRⅡ在不同分期EML4-ALK融合基因表达阳性肺腺癌中的临床意义，并对TGFβRⅡ进行肺腺癌临床治疗指导策略。　　方法：本研究分为两部分。第一部分为临床病理研究，我们从广州医科大学附属第一医院收集自2008年12月至2013年12月期间共484例肺腺癌患者经手术切除的石蜡包埋肿瘤组织样本。通过免疫组化（SP）对病理组织中ALK进行免疫染色，和通过实时荧光定量PCR（qPCR）对病理组织样本中ALK mRNA检测定量，从而鉴定出临床肺腺癌患者的石蜡组织样本中EML4-ALK融合基因分型。分型后筛选出ALK表达阳性的患者肿瘤组织石蜡样本，对其不同临床分期进行分组。整理临床资料，分析不同分期EML4-ALK阳性肺腺癌患者临床病理特征并通过qPCR技术检测TGFβRⅡ在ⅠA期、ⅢA期EML4-ALK融合基因阳性样本中的表达水平。第二部分为体外细胞研究，实验分为两个小组，LV-shRNA-TGFβRⅡ细胞组，和LV-shRNA-GP细胞组。构建稳定表达细胞株后，运用Transwell验证TGFβRⅡ对肺腺癌H3122细胞侵袭的影响。统计学分析利用SPSS22.0统计软件，以单因素方差分析结果，用t检验作统计学处理，P值＜0.05认为有统计学意义。　　结果：第一部分临床病理研究中：免疫组化以及qPCR检测肺腺癌患者切除的病理组织蜡块结果显示484例肺腺癌患者中，ALK表达阳性患者共28例（5.85%），其中ⅠA期11例，ⅢA期9例。分析ⅠA期、ⅢA期EML4-ALK融合基因阳性患者临床病理特征，ⅠA期和ⅢA期小于60岁患者分别为5例、6例，大于或等于60岁患者分别为6例、3例，吸烟者分别为3例、5例，不吸烟者分别为8例、4例，两者在年龄、吸烟方面统计学上无差异（P＞0.05）；对该20例样本进行qPCR检测，结果显示ⅠA期EML4-ALK阳性肺腺癌组织中TGFβRⅡmRNA相对表达量明显高于ⅢA期；第二部分体外细胞研究中：成功构建LV-shRNA-TGFβRⅡ/H3122细胞克隆，TGFβRⅡ的沉默效率为85.97%；LV-shRNA-TGFβRⅡ-H3122细胞组通过Transwell的细胞数多于LV-shRNA-GP-H3122细胞组（P<0.05）。　　结论：EML4-ALK融合基因阳性不同分期肺癌组织中TGFβRⅡ表达具有明显差异。EML4-ALK阳性肺腺癌中晚期肿瘤组织TGFβRⅡmRNA表达水平明显低于早期肿瘤组织，沉默TGFβRⅡ基因后ALK阳性肺腺癌细胞侵袭性明显增强，TGFβRⅡ低表达将促进EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌患者发病进程。

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