抗凋亡蛋白Mcl-1及Siah-1S在细胞凋亡中的作用机制研究

摘要

Mcl-1作为抗凋亡Bcl-2家族蛋白成员之一，可以阻断多种凋亡诱导剂所诱导的细胞凋亡，然而Mcl-1抑制细胞凋亡的分子机制并没有被完全地弄清楚。 在我们的研究中，我们发现Mcl-1可以和促凋亡Bcl-2家族蛋白Puma相互作用，它们之间的相互作用分别由Mcl-1的BH1结构域和Puma的BH3结构域介导。免疫荧光结果显示Mcl-1和Puma可以共定位于线粒体，暗示Mcl-1和Puma之间的结合是发生在线粒体上的。进一步的研究结果表明Mcl-1．可以抑制Puma诱导的细胞凋亡，而且Mcl-1的BH1结构域对于其抗Puma诱导的细胞凋亡起着重要的作用。有意思的是，Mcl-1的蛋白稳定性可以被Puma提高，而且这种Mcl-1蛋白稳定性的提高是由于和Puma的直接结合而引起的，因为将Puma的BH3结构域去除之后，Puma就不再能提高Mcl-1的蛋白稳定性，我们同时也证明了Puma结合Mcl-1只能部分而不能完全地阻止Mcl-1的快速降解。最后我们发现除了PEST和BH1结构域介导Mcl-1的快速降解之外，还存在其它的降解信号，而且位于Mcl-1蛋白的C末端。我们的这些结果第一次清楚地阐明了Mcl-1可以和Puma相互作用，而且暗示了Mcl-1可能通过和Puma结合而提高自身稳定性最终行使抗凋亡的功能。 另外，我们在研究中发现促凋亡Bcl-2家族蛋白Noxa的蛋白水平在喜树碱(CPT)诱导的细胞凋亡中可以被上调，而且这一过程是不依赖于p53的。除此之外，我们证明了P13K/Akt信号通路在CPT诱导的Noxa上调过程中起着非常重要的作用。luciferase assay以及CREB knock-down的实验结果进一步显示CREB介导了CPT诱导的Noxa转录水平的上调。更重要的是，用RNAi的方法将Noxa的蛋白水平抑制之后可以显著地抑制CPT诱导的细胞凋亡，暗示Noxa在CPT诱导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用。有意思的是，Mcl-1的蛋白水平也可以通过P13K/Akt信号通路而被CPT上调。通过免疫共沉淀实验，我们证明了不管有没有CPT处理的情况下Noxa都可以和Mcl-1相互作用，说明Noxa和Mcl-1之间应该存在一个平衡，从而调节细胞凋亡。通过抑制Mcl-1的蛋白水平以及在细胞内过量表达Mcl-1的实验，我们发现Mcl-1蛋白水平的抑制会使得细胞对于CPT诱导的细胞凋亡更加的敏感，而过量表达Mcl-1则可以显著地抑制CPT以及CPT和LY294002诱导的细胞凋亡。综合这些结果说明N0×a和Mcl-1之间的平衡可以调节细胞对于CPT诱导细胞凋亡的敏感度。综上所述，我们的实验结果暗示了Mcl-1可以通过和Puma以及Noxa相互作用从而发挥其抗凋亡功能。 Siah-1(seven in absentia homolog)可以和SIP(Siah-1-interacting protein)，Skp1，以及Ebi相互作用形成一个泛素连接酶复合物从而降解β-catenin。在我们的研究中，我们发现了一个新的Siah-1剪切异构体并将它命名为Siah-1S，Siah-1S被证明是通过自身剪切而产生的。有意思的是，Siah-1在剪切的过程中产生的内含子并不符合经典的内含子边界：GT-AG或AT-AC。通过比较Siah-1和Siah-1S的蛋白半衰期，我们发现Siah-1S比Siah-1更加的不稳定；和Siah-1类似，Siah-1S也可以发生自身泛素化并最终通过泛素-蛋白酶体途径而被降解。Siah-1S可以提高β-catenin的蛋白水平以及增强Tcf/Lef的转录活性，而且Siah-1S可以对抗Siah-1对于Etoposide诱导的细胞凋亡的增强作用。另外我们发现Siah-1S不仅可以和Siah-1结合形成异源二聚体，也可以和自身形成同源二聚体。和Siah-1<'*>Siah-1二聚体不同，Siah-1<'*>Siah-1S、以及Siah-1S<'*>Siah-1S都失去了和SIP的结合能力，这个结果可以部分地解释为什么Siah-1S可以行使Siah-1的dominant negative抑制子的作用。最后我们证明了Siah-1S可以在体外促进肿瘤细胞的成瘤能力，暗示Siah-1S可能在肿瘤的形成过程中发挥了重要的作用。

目录

论文说明：缩略语

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致谢

第一部分Bcl-2家族蛋白Mcl-1在细胞凋亡中的作用机制研究

摘要

第一章文献综述

第一节细胞凋亡及其信号转导

第二节Bcl-2家族蛋白及Mcl-1的研究进展

第二章实验结果及讨论

第一节Puma和Mcl-1的结合可以提高Mcl-1的蛋白稳定性

第二节Noxa/Mcl-1蛋白平衡调节细胞对于CPT诱导凋亡的敏感度

第二部分一个新的Siah-1的剪切异构体--Siah-1S的鉴定与功能分析

摘要

第一章文献综述 Siah-1蛋白的研究现状

第二章实验结果及讨论

一、研究结果

二、结果分析与讨论

三、本章小结

第三部分、实验材料与方法

第一章实验材料

第二章常用实验技术及方法

第四部分参考文献

攻读博士学位期间已发表和待发表的学术论文

攻读博士学位期间所参加的学术会议及活动

攻读博士学位期间所获得的各种奖励

英文发表论文1

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