电针对溶血卵磷脂引起坐骨神经脱髓鞘模型大鼠髓鞘修复的影响

摘要

外周神经脱髓鞘疾病是由于各种感染、遗传性或者免疫性相关机制破坏施万细胞(又称施旺或雪旺细胞)功能引起外周神经髓鞘完全或部分脱落，最终导致感觉和运动功能障碍的一类疾病。这类疾病预后很差，且目前缺乏有效的治疗方法，给患者和整个社会都带来很大的负担。因此，亟需寻找其他有效的治疗方法。临床研究显示针灸可以有效缓解急性格林-巴利综合征和腓骨肌萎缩症等外周脱髓鞘疾病的症状，但其具体机制尚未明确，且相关的研究目前仍相对较少。　　研究目的：　　本课题拟以溶血卵磷脂(1ysophosphatidylch01ine，LPC)引起的坐骨神经局部脱髓鞘模型大鼠为观察对象，研究电针“后三里”和“阳陵泉”穴对恢复脱髓鞘模型大鼠的运动和感觉功能的作用。在此基础上，结合行为学、神经示踪术、免疫荧光组织化学、分子生物学、共聚焦立体成像等技术，从行为改变、坐骨神经脱髓鞘局部变化、脊神经节(dorsal root ganglia，DRG)中不同类型神经元以及脊髓中相关化学物质的变化等方面分析针灸促进脱髓鞘模型大鼠髓鞘修复的机制，从而为临床应用电针改善外周脱髓鞘疾病提供依据。　　研究方法：　　1观察电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠相关神经通路的影响　　分为4组，每组4只大鼠。　　正常组：在异氟烷麻醉状态下，暴露左侧坐骨神经，用微量注射器将0.5μl1％霍乱毒素亚单位B(cholera toxin subunit B，CTB)注入距离坐骨切迹远端10nm处的坐骨神经干中。　　模型7d组：麻醉状态下建模，首先暴露左侧坐骨神经，用微量注射器将5μl的2％LPC注入距离坐骨切迹远端5nm处的坐骨神经干中。其次，根据以往研究，该模型在第7d时脱髓鞘最严重，所以在建模第7d再用微量注射器将0.5μl1％CTB注入距离坐骨切迹远端10mm处的左侧坐骨神经干中，第10d取材。　　模型14d组：建模方法同上。在建模第14d时再用微量注射器将0.5μl1％CTB注入距离坐骨切迹远端10nm处的左侧坐骨神经干中，第17d取材。　　电针组：建模大鼠从第8d开始在异氟烷麻醉状态下，对大鼠左侧“后三里”和“阳陵泉”穴进行针刺。刺入后连接电针仪，将刺激参数调整为：2/15Hz，1mA，30min。每日1次，持续7d。电针结束后，第14d时再用微量注射器将0.5μ11％CTB注入距离坐骨切迹远端10rnin处的坐骨神经干中，第17d取材。　　各组动物均在示踪剂注入3d后进行灌流取材，先用4％多聚甲醛溶液将大鼠经心脏灌流固定，然后取出脊髓、腰(1umbar，L)4-L6节段DRG、局部注射处坐骨神经，再将取出的组织放于25％蔗糖溶液中脱水24h后，切片制备后用于荧光免疫组化染色。其中坐骨神经主要观察髓鞘相关蛋白髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)和神经微丝蛋白200(neurofilament200，NF200)表达变化。　　2观察电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠行为学的影响　　实验1基础上确定造模、干预及观察的时间点，重新确定分组。分为4组，每组12只大鼠。　　正常组：坐骨神经内未注射任何物质。　　对照组(生理盐水组)：在异氟烷麻醉状态下，暴露左侧坐骨神经，用微量注射器将5μl0.9％氯化钠溶液注入距离坐骨切迹远端5mm处的坐骨神经干中。　　模型组：同样大鼠在异氟烷麻醉状态下，暴露左侧坐骨神经，用微量注射器将5μ12％LPC注入距离坐骨切迹远端5nm处的坐骨神经干中。　　电针组：建模大鼠从第8d开始在异氟烷麻醉状态下，对左侧“后三里”及“阳陵泉”穴进行针刺。刺入后连接电针仪，将刺激参数调整为：2/15Hz，1mA，30min。每日一次，持续7d。　　各组大鼠分别在造模前、造模后第7d和第14d，进行坐骨神经功能指数(sciatic nerve function index，SFI)分析、机械痛阂和热痛阈的测定。电针结束且进行功能测定后处死大鼠，每组中6只取出新鲜的坐骨神经组织，以备蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)方法检测使用;另外6只经多聚甲醛心脏灌流固定后，取出坐骨神经，用于形态学实验。　　3观察电针对坐骨神经脱懿鞘模型大鼠坐骨神经中细胞外蛋白调节激酶1/2(extraceilular regulated protein kinases1/2，ERKl/2)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)以及链鞘特异性蛋白表达的影响　　在第2部分的实验确定电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠行为学有差异的基础上，进一步观察脱髓鞘后ERK1/2、GFAP以及髓鞘特异性蛋白表达的差异。　　该部分实验分为4组，分组条件与第2部分相同，将第2部分每组中的12只大鼠经行为学检测结束后取出6只，用WB检测坐骨神经中相关蛋白的表达变化，检测指标包括：ERKl/2，GR心，髓鞘相关蛋白MBP、髓鞘蛋白0(myelin protein zero，PO)含量变化，以观察电针对局部脱髓鞘后髓鞘修复的作用。　　4观察电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠对应节段DRG中不同类型神经元及脊髓中相关化学物质表达的影响　　该部分实验分为4组，分组条件与第2部分相同，将第2部分每组中的12只大鼠经行为学检测结束后取出6只，经心脏灌流，通过荧光免疫组化方法检测L4一L6节段DRG和脊髓中不同类型神经元及其化学表达的变化，探讨DRG和脊髓中参与电针促进神经脱髓鞘后髓鞘再生的相关成分。其中主要指标包括：NF200、异凝集素B4(isolectin B4，IB4)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)、神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)、离子钙接头结合蛋白1(ionized calcium binding adaptor molecule.1，Iba1)。　　研究结果：　　1电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠相关神经通路的影响　　将CTB分别注射到正常组、模型7d组、模型14d组及电针组大鼠坐骨神经干中，注射3d后可观察到CTB标记的运动神经元、感觉神经元及神经纤维终末分别位于注射同侧的脊髓前角、DRG及脊髓背角。其中运动神经元部分，造模后，7d组与正常组对比，CTB标记的运动神经元在脊髓前角分布的数量明显增多;而7d组与14d组对比，CTB标记的运动神经元数量无明显变化;电针干预后，与14d模型组对比，CTB标记的运动神经元数量增加。同时，感觉神经元部分，CTB标记的与坐骨神经相关的感觉神经元分布在L4.L6DRG，主要集中于L4DRG。感觉神经元按大小可分为大(＞50μm)、中(30-50μm)、小(＜50μm)型3类神经元。正常组大鼠注射CTB后标记的大、中、小型感觉神经元占神经元总数的比例分别为81％、17％、2％;造模7d组大鼠的大、中、小型感觉神经元分别占55％、31％、14％;造模14d组分别为57％、23％、20％;电针组分别为70％、19％、11％，各组间标记的感觉神经元总数未见明显差异。　　此外，通过对局部注射处的坐骨神经观察可见造模7d后，坐骨神经中轴突无明显变化，但坐骨神经注射LPC处局部髓鞘特异性蛋白MBP全部脱落，造模14d后，MBP表达量有所增加，电针干预后，MBP表达量同样上调。　　2电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠的行为学变化的影响　　SFI方面，造模前，各组大鼠SFI无明显差异;造模7d后，生理盐水组与正常组比较无明显差异，模型组及电针组的SFI与生理盐水组比较显著下降(P＜0.05);电针干预7d后，电针组的SFI与模型组比较显著升高(P＜0.05)。　　痛阈方面，造模前，各组大鼠机械痛阈、热痛阈无明显差异，造模7d后，生理盐水组与正常组比较无明显差异，模型组及电针组的机械痛阈、热痛阈与生理盐水组比较均明显下降(均P＜0.05);电针干预7d后，电针组的机械痛阈、热痛阈与模型组比较均明显升高(均P＜0.05)。　　3电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠坐骨神经中ERK1/2、GFAP以及懿鞘特异性蛋白表达的影响　　造模后，髓鞘特异性蛋白MBP表达量下调(P＜0.05)，ERK1/2蛋白表达量明显下调(P＜0.05);给予电针后，与模型组比较，电针组ERK1/2、GFAP表达量下调(P＜0.05)，髓鞘特异性蛋白MBP表达量上调(P＜0.05)。　　研究结论：　　1在行为学方面，电针可改善坐骨神经运动功能，并缓解外周脱髓鞘引起的机械痛及热痛。　　2电针下调不形成髓鞘的施万细胞和促施万细胞去分化因子的表达，可能是电针促进髓鞘修复的主要机制。　　3电针通过减少DRG中NPY、nNOS阳性表达神经元和脊髓中nNOS阳性表达神经元的数量，及抑制其周围小胶质细胞、星形胶质细胞的活化，可能是电针对外周脱髓鞘疾病发挥镇痛作用的主要机制。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

文献综述

前言

材料与方法

结果

1电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠相关神经通路的影响

2电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠行为学的影响

3电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠坐骨神经中ERK1／2、GFAP以及髓鞘特异性蛋白表达的影响

4电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠对应节段DRG中不同类型神经元及脊髓中相关化学物质表达的影响

讨论

1电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠相关神经通路的影响

2电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠行为学的影响

3电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠坐骨神经中ERK1／2、GFAP以及髓鞘特异性蛋白表达的影响

4电针对坐骨神经脱髓鞘模型大鼠对应节段DRG中不同类型神经元及脊髓中相关化学物质表达的影响

结论

展望

参考文献

致谢

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