不同来源BM-MSCs对脱髓鞘模型髓鞘修复及情感障碍影响及机制的初步研究

摘要

中枢神经系统(Central nervous system，CNS)的髓鞘是由少突胶质细胞的片状突起包绕神经元轴突而形成的具有保护轴索、传导神经冲动和绝缘等作用的螺旋形膜性结构。多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一种自身免疫性疾病，以中枢神经系统白质脱髓鞘为主要病理特点，好发于中青年，病变多发导致神经功能缺损大，从而引起不同程度的生理和心理障碍，且每况愈下，致残率极高，使MS患者的身心均受到巨大重创，极易引起精神症状，多表现为抑郁、焦虑和易怒等，其生活质量严重受损，并影响患者对治疗的依从性，故MS合并焦虑抑郁障碍越来越受到学术界及临床医生的重视。大量研究表明MS合并焦虑抑郁的机制有脑萎缩、炎症因子的作用、药物影响、认知障碍和社会心理因素引起。目前，MS的临床治疗以糖皮质激素、大剂量免疫球蛋白、β-干扰素及免疫抑制剂为主，MS并发焦虑抑郁障碍的临床治疗方法包括抗焦虑抑郁药物和心理行为治疗等对症治疗。故如何促进髓鞘再生和功能修复及逆转疾病的进程是MS合并焦虑抑郁障碍治疗的关键点。
　　目前，干细胞移植是再生医学研究中最有希望的方法之一，而骨髓间充质干细胞(Bone marrowed-mesenchymal stem cells，BM-MSCs)以其独特的生物学特性和临床应用前景成为近来研究的热点。骨髓间充质干细胞是不同于骨髓造血干细胞的一类多能干细胞群，具有体外易获得、增殖力强、多向分化潜能、表面抗原不明显等特点，多次传代后仍保持干细胞特性，且移植到体内免疫排斥反应弱，它的这些生物学特性使其应用于自身免疫性疾病、神经系统疾病、血液病、骨与软骨疾病、肝衰竭等疾病的治疗研究中。大量实验研究表明骨髓间充质干细胞对多发性硬化有治疗作用，但其作用机制尚存在争议，大多数学者认为这主要是通过调节免疫应答实现。
　　目前关于BM-MSCs移植治疗的争议之一是BM-MSCs自体移植与异体移植哪一个更好？BM-MSCs体外扩增后进行自体移植，可避免组织配型、免疫排斥和医学伦理方面的问题，然而重要的是要考虑到患者自体的骨髓间充质干细胞是否也受到病理环境的影响，从而降低其治疗疾病的效果。另一方面，从理论上来说，BM-MSCs具有免疫原性低和免疫负性调节作用，可诱导同种异体移植的免疫耐受作用，通过同种异体移植在组织再生和功能修复中发挥重要作用。但有关不同来源的BM-MSCs对MS的髓鞘修复作用的对比研究，鲜有报道。双环己酮草酰二腙(Cuprizone，CPZ)是一种选择性铜离子螯合剂，小剂量能够靶向损伤少突胶质细胞的线粒体，使形成髓鞘的少突胶质细胞死亡，诱导中枢神经系统髓鞘脱失，常作为诱导因子建立脱髓鞘动物模型。CPZ诱导的脱髓鞘模型与实验性自身免疫性脑脊髓炎模型（Experimental allergicencephalopalomyelitis，EAE）最大的不同在于其诱导模型的过程中不涉及免疫系统的复杂反应，并且有部分学者将CPZ诱导的慢性脱髓鞘模型作为精神障碍的相关模型。
　　因此，我们拟采用CPZ诱导的小鼠慢性脱髓鞘模型，应用免疫组化、分子生物学、病理学及动物行为学研究等方法，首先观察正常小鼠BM-MSCs对CPZ诱导的小鼠慢性脱髓鞘模型修复作用及其焦虑抑郁的影响，同时观察实验小鼠血清神经递质变化，进而比较不同来源BM-MSCs对模型小鼠髓鞘的修复作用影响，初步探明哪一种来源的BM-MSCs对模型小鼠髓鞘的修复作用更好，并从分泌蛋白组学初步探讨产生修复差异的机制，为临床MS患者BM-MSCs治疗提供一定理论依据。
　　第一部分 骨髓间充质干细胞对Cuprizone诱导的脱髓鞘小鼠模型髓鞘修复和情绪影响的实验研究
　　方法：
　　1.1选取8周龄C57BL/6雄性小鼠70只，分为正常对照组和实验组，实验组又分为慢性脱髓鞘组、髓鞘修复组和细胞治疗组。正常对照组喂养正常鼠粮14周，实验组连续喂养CPZ鼠粮12周后，髓鞘修复组和细胞治疗组改为喂养正常鼠粮2周，同时在诱导第13周时对细胞治疗组进行BM-MSCs细胞注射，慢性脱髓鞘组则继续喂养CPZ鼠粮。
　　1.2运用全骨髓培养法及密度梯度离心法从幼年C57BL/6小鼠的骨髓中提取骨髓间充质干细胞，进行培养、鉴定、移植。
　　1.3每周测量2次体重，观察并记录各组小鼠的体重变化。
　　1.4通过旷场试验、高架十字迷宫实验及悬尾实验检测各组小鼠的行为学变化。
　　1.5采用卢卡斯快蓝染色、MBP免疫荧光染色及电镜技术观察各组小鼠脑组织胼胝体区的髓鞘脱失情况。GFAP免疫荧光染色测量胼胝体区及皮质区星形胶质细胞的变化。
　　1.6利用酶联免疫吸附法(ELISA)和高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）测定各组小鼠血清神经递质及其代谢产物的浓度。
　　结果：
　　2.1原代BM-MSCs培养24-48小时即可贴壁。培养至第2代时对其细胞表型标记CD29、CD90进行免疫荧光染色，可见阳性率可达90％以上，待模型诱导完成后进行细胞移植发现，BM-MSCs可迁移至脑组织脱髓鞘区。
　　2.2与正常对照组比较，实验组前期体重上升缓慢，喂养至15周可见锈鞘修复组(29.93±2.74)g与细胞治疗组（32.33±2.96）g小鼠的体重明显升高，且与慢性脱髓鞘组（27.98±3.31）g比较，正常对照组（33.85±1.70）g及细胞治疗组小鼠的体重差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.3行为学实验显示:旷场实验中的中央路程比及高架十字迷宫实验开臂滞留时间百分比(OT％)及开臂进入次数百分比(OE％)反映实验小鼠的焦虑行为，悬尾实验的不动时间反映小鼠的抑郁行为，可见慢性脱髓鞘组小鼠的中央路程比（0.07±0.03），OT为（15.50±5.03）％，OE为(14.10±6.54)％，不动时间为(170.08±21.69)s;正常对照组小鼠的中央路程比为（0.12±0.03），OT为(25.92±5.43)％，OE为(31.33±5.69)％，不动时间为（121.33±38.66）s;与正常对照组比较，慢性脱髓鞘组小鼠表现出明显的焦虑抑郁行为(P＜0.05);经过细胞治疗后，细胞治疗组小鼠的中央路程比为(0.11±0.04)，OT为（21.64±3.42）％，OE为（26.54±6.49）％，不动时间为（134.67±37.49）s，与慢性脱髓鞘组比较其焦虑抑郁行为有明显改善(P＜0.05)。
　　2.4通过对各组小鼠脑组织胼胝体区域的MBP、LFB染色及电镜检测可见，与正常对照组小鼠脑组织染色OD值（0.29±0.09）相比，慢性脱髓鞘组小鼠胼胝体区域髓鞘脱失明显（0.14±0.07）(P＜0.01)，而细胞治疗组（0.25±0.08）及髓鞘修复组(0.21±0.09)较慢性脱髓鞘组的髓鞘有所修复(P＜0.05)，且细胞治疗组较髓鞘修复组胼胝体区髓鞘修复效果更明显(P＜0.05)。采用GFAP免疫荧光染色技术发现，慢性脱髓鞘组较正常对照组小鼠胼胝体区（78.12±15.47）V.S（21.56±10.63）及皮层区(101.15±23.30)V.S(34.67±12.25)星形胶质细胞的数量明显升高(P＜0.01)，然而细胞治疗组小鼠胼胝体区（59.07±25.36）及皮层区（41.11±17.42）GFAP的表达比慢性脱髓鞘组及髓鞘修复组有所下降(P＜0.05)。
　　2.5利用HPLC-ECD测得正常对照组小鼠血清NE、5-HT和5-HIAA的浓度分别为1.32±0.92ng/L、126.04±22.43ng/L、27.26±3.17ng/L，慢性脱髓鞘组依次为2.82±1.01ng/L、159.68±23.06ng/L、43.89±6.59ng/L，两组在血清NE、5-HT和5-HIAA浓度差异显著(P＜0.05)，与慢性脱髓鞘组相比，细胞治疗组小鼠血清5-HT（27.77±5.81ng/L）和(5-HIAA1.10±0.76ng/L)浓度有所降低(P＜0.05)。ELISA显示:正常对照组与慢性脱髓鞘组小鼠血清NE（23.82±19.65）V.S（50.83±17.64）和5-HT（39.72±19.16）V.S（99.30±29.11）浓度存在差异（P＜0.05），细胞治疗组与慢性脱髓鞘组相比，其小鼠血清NE（25.58±19.33）及5-HT（54.83±18.41）的浓度有下降(P＜0.05)。
　　结论：
　　从行为学、病理改变等方面证实CPZ诱导的脱髓鞘模型是可行的。CPZ诱导的脱髓鞘模型小鼠表现出焦虑抑郁样行为，这可能与中枢神经系统的髓鞘脱失以及脱髓鞘环境下所引起的单胺类神经递质含量的变化有关;该模型适合作为MS合并焦虑抑郁障碍的实验载体，BM-MSCs移植能促进脱髓鞘模型的髓鞘修复及情绪改善。
　　第二部分 不同来源骨髓间充质干细胞对Cuprizone诱导的小鼠脱髓鞘模型髓鞘修复作用的对比研究
　　方法：
　　1.1周龄C57BL/6雄性小鼠40只，分为正常对照组和实验组，实验组又分为来源于同种干细胞干预组组、来源于异种干细胞干预组及病理对照组，模型诱导方法及细胞治疗方法同上。
　　1.2采用密度梯度离心法从人的骨髓中提取MSCs，并培养、鉴定及移植。
　　1.3利用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)检测Cuprizone药物对小鼠的MSCs的是否存在毒性作用，比较健康志愿者及MS患者来源的MSCs的增殖能力并判断是否存在差异。
　　1.4细胞移植2周后行行为学及病理学检测，以比较不同来源MSCs对髓鞘修复及功能恢复能力是否存在差异。
　　1.5通过蛋白免疫印迹技术(WB)对细胞培养上清及细胞内的肝细胞生长因子(HGF)进行定量分析。
　　结果：
　　2.1人骨髓提取的原代BM-MSCs培养48-72小时可贴壁。10-14天后即可传代，传至第2代时经流式细胞术检测其表型，可见表达CD90阳性的细胞比例为99.12％，CD105的阳性率为82.41％，CD73为99.94％，表达CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR阳性的细胞比例为0.34％。
　　2.2通过CCK-8检测显示，与来源正常小鼠的BM-MSCs(Norml cells)相比，来源病理组小鼠的BM-MSCs(CPZ cells)增殖能力下降(P＜0.01)，Cuprizone药物对来源正常小鼠的BM-MSCs的增殖能力无明显影响;来源健康志愿者及MS患者的BM-MSCs在增殖力方面存在差异(P＜0.01)。
　　2.3细胞移植2周后对各组小鼠行行为学检测发现，在旷场实验中与MS患者来源干细胞干预组小鼠总路程（8304.91±1188.34）cm比较，志愿者来源干细胞干预组小鼠总路程（（6883.99±1246.70）呈现出运动能力的提升(P＜0.05)。病理学染色显示:与来源MS患者干细胞干预组（0.19±0.08）相比，来源志愿者干细胞干预组小鼠（0.27±0.06）的髓鞘修复效果更佳(P＜0.05)。来源正常小鼠干细胞干预组CC区及CTX区活化的星形胶质细胞数为(44.34±10.27)及（52.02±12.02），来源病理组小鼠干细胞干预组CC区及CTX区为(67.34±11.74)及（72.02±17.53），两组间差异显著(P＜0.01);来源志愿者干细胞干预组CC区及CTX区的星形胶质细胞数量为(38.34±12.46)、（47.36±9.69）较来源MS患者干细胞干预组CC区及CTX区(65.61±12.58)、(86.02±16.14)的数量明显减少(P＜0.01)。
　　2.4利用WB对目的蛋白肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)进行检测发现，健康来源（小鼠/人）HGF的OD值为（0.40±0.11）（0.37±0.06）比病态来源（小鼠/人）骨髓间充质干细胞培养上清中HGF的OD值（0.33±0.08）（0.28±0.10）高(P＜0.05);与CPZ小鼠骨髓间充质干细胞（0.21±0.05）相比，正常小鼠骨髓间充质干细胞内（0.28±0.05）的HGF表达量较高(P＜0.05)。
　　结论：
　　健康来源的MSCs在促进髓鞘修复和功能恢复方面比病态来源的MSCs更有效，其机制可能与旁分泌营养因子及增殖能力的差异有关。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 骨髓间充质干细胞对Cuprizone诱导的小鼠脱髓鞘模型髓鞘修复和情绪影响的实验研究

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 不同来源骨髓间充质干细胞对Cuprizone诱导的脱髓鞘小鼠模型髓鞘修复作用的对比研究

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 结论

全文总结

参考文献

文献综述 间充质干细胞的分泌功能与其在神经修复过程中的作用

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