日本黄姑鱼皮胶原蛋白理化特性及其胶原蛋白肽活性研究

摘要

近年来，随着海产品加工业的蓬勃发展，产生了大量的副产品，这些副产品要么被丢弃，要么仅仅用作动物饲料或肥料。因此，迫切需要利用这些副产品生产高附加值产品。海洋资源生物活性肽具有许多生理功能，包括抗氧化、抗肿瘤、抗菌、血管紧张素转换酶(ACE)抑制、护肝和促伤口愈合等活性。此外，加工废弃物中的鱼皮、鱼骨、鱼鳞等中含有丰富的胶原蛋白。因此，从海产品加工废弃物中提取胶原蛋白或生物活性肽可为其高值化利用提供新的途径，从而减少环境污染，并创造巨大的经济效益。本实验以日本黄姑鱼鱼皮为原料，提取胶原蛋白并测定其理化特性和功能特性，为其在化妆品添加剂或生物材料的应用中奠定基础。此外，利用日本黄姑鱼鱼皮制备胶原蛋白肽，测定其理化特性和功能特性，为其促伤口愈合奠定基础。本实验的主要研究结果如下:　　(1)利用单因素和响应面试验对日本黄姑鱼鱼皮酶溶性胶原蛋白(PSC)的酶解条件进行优化，经过回归拟合得到加酶量、料液比和酶解时间的二次多项回归方程为:提取率=83.73+3.53X1+1.47X2+1.78X3-0.11X1X2-0.59X1X3-0.80X2X3-3.68X12-2.03X22-1.89X32。回归拟合和验证试验后最终确定最佳提取工艺参数为加酶量1389U/g、料液比1∶57和酶解时间8.67h，在此条件下PSC提取率最大为85.03％。对PSC提取率影响最大的是加酶量，酶解时间次之，料液比最小。　　(2)提取日本黄姑鱼鱼皮酸溶性胶原蛋白(ASC)，并测定ASC和PSC理化性质和功能特性。测定结果显示:ASC和PSC的提取率分别为15.35％和20.23％(干重);两种胶原蛋白含有丰富的甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp)，其中Gly含量最多，分别为35.1％和34.8％;ASC和PSC的热变性温度都大约在34.5℃;ASC和PSC蛋白图谱相似，是由2条α1和1条α2肽链组成的三聚体，表明ASC和PSC均属Ⅰ型胶原((α1)2α2);ASC和PSC都有5个酰胺带分别是酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ带;ASC和PSC中As、Pb和Hg的含量均低于国家标准;与甘油相比，PSC有很好的吸湿保湿性，对小鼠成纤维细胞NIH-3T3无毒性和致敏性。　　(3)制备胶原蛋白肽，并以DPPH自由基清除率为指标进行筛酶实验和单因素实验对酶解工艺进行优化，测定所提取的日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白肽(MCPs)理化性质和生物活性。结果显示:中性蛋白酶为最优酶;单因素结果显示，最优的酶解条件是:酶解温度45℃、酶解时间5h、pH7.0、料液比为1∶6和加酶量1500U/g;MCPs的分子量主要集中在＜1kDa;MCPs具有显著的抗氧化活性;同时，MCPs具有促细胞增殖和迁移的活性。Western blotting结果表明，MCPs可提高NF-κB信号通路中NF-κBp65，IKKα和IKKβ的表达水平，也可提高相关生长因子如EGF、FGF、VEGF和TGF-β的蛋白表达水平。

目录

声明

摘要

第一章前言

1．1胶原蛋白的类型

1．2胶原蛋白的结构特点

1．3胶原蛋白的提取方法

1．4胶原蛋白的理化性质

1．4．1胶原蛋白的氨基酸组成

1．4．2胶原蛋白的热稳定性

1．4．3胶原蛋白其它理化性质

1．5胶原蛋白的应用

1．5．1胶原蛋白在食品中的应用

1．5．2胶原蛋白在化妆品中的应用

1．5．3胶原蛋白在医学中的应用

1．6海洋胶原蛋白肽的制备方法

1．7海洋胶原蛋白肽的生物活性

1．7．1抗衰老性

1．7．2抗氧化活性

1．7．3抗菌活性

1．7．4促伤口愈合性

1．8本研究的目的和意义

第二章日本黄姑鱼鱼皮酶溶性胶原蛋白提取工艺条件的优化

2．1材料

2．1．1实验材料

2．1．2主要试剂

2．1．3仪器与设备

2．2方法

2．2．1日本黄姑鱼鱼皮预处理

2．2．2酶法提取日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白

2．2．3单因素试验

2．2．4响应面试验设计

2．2．5胶原蛋白含量的测定

2．2．6统计方法

2．3实验结果

2．3．1羟脯氨酸标准曲线的测定结果

2．3．2日本黄姑鱼鱼皮中羟脯氨酸含量的测定结果

2．3．3单因素实验结果

2．3．4响应面对PSC提取条件的优化结果

2．4结论

第三章日本黄姑鱼鱼皮酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白的理化特性研究

3．1材料

3．1．1细胞与样品

3．1．2药物与试剂

3．1．3主要仪器

3．2方法

3．2．1细胞培养

3．2．2酸法提取ASC

3．2．3氨基酸分析

3．2．4热变性温度的测定

3．2．8水合性质测定

3．2．9细胞毒性检钡JJ(MTT法)

3．2．10细胞致敏性分析(乳酸脱氢酶(LDH)释放法)

3．2．11倒置显微镜观察细胞形态

3．2．12统计方法

3．3结果

3．3．1 ASC和PSC提取率结果

3．3．2氨基酸组成结果

3．3．3热变性温度测定结果

3．3．4 SDS-PAGE分析结果

3．3．5红外光谱分析结果

3．3．6电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析结果

3．3．7 PSC的吸湿保湿性质测定结果

3．3．8 PSC对小鼠成纤维细胞NIH-3T3毒性分析结果

3．3．9 PSC对小鼠成纤维细胞NIH-3T3过敏性分析结果

3．3．10形态学分析结果

3．4结论

第四章胶原蛋白肽的制备及其功能活性评价

4．1材料

4．1．1实验材料

4．1．2药物与试剂

4．1．3主要仪器

4．2方法

4．2．1 MCPs的制备

4．2．2 MCPs的分子量测定

4．2．3 MCPs的氨基酸组成测定

4．2．4抗氧化活性评价

4．2．5细胞增殖实验

4．2．6细胞划痕实验

4．2．7 Western Blot检测蛋白表达情况

4．2．8统计方法

4．3结果

4．3．1酶种筛选结果

4．3．2单因素实验结果

4．3．3 MCPs的分子量分布测定结果

4．3．4 MCPs的氨基酸组成测定结果

4．3．5 MCPs的抗氧化活性测定

4．3．6细胞增殖实验结果

4．3．7细胞划痕实验结果

4．3．8 Western Blot检测蛋白表达结果

4．4结论

第五章结论与展望

5．1结论

5．2展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果