黄花棘豆响应非生物胁迫转录组分析及干旱胁迫信号通路的研究

摘要

黄花棘豆（Oxytropis ochrocephala Bunge）是豆科棘豆属多年生草木植物，其植株富含生物碱等有毒成分，动物大量采食后会引起中毒甚至死亡，其分布面积广，蔓延迅速，容易形成优势群落。目前关于黄花棘豆的研究主要集中在成分鉴定、毒理分析以及化感作用等方面，在分子水平上对其环境适应性和抗逆机理的研究十分有限。为了明确黄花棘豆逆境生理特征及抗逆分了机制，以便制定有效可行的防控措施，本研究以黄花棘豆幼苗为材料，利用高通量测序技术获得黄花棘豆响应干旱、盐、低温胁迫的转录组信息，并利用生物信息学方法筛选一系列逆境响应功能基因，在转录水平上分析功能基因的表达模式；同时重点研究了在干旱胁迫‘卜．黄花棘豆内源信号分子NO参与依赖ABA的信号通路，调控植株干旱适应性的过程，为研究黄花棘豆的抗逆机制提供理论依据。主要研究结果如下：　　(1)黄花棘豆为中等抗旱耐低温植物，能在低盐环境中生长。低温胁迫的植株电导率和丙二醛含量低于干旱和盐处理植株，并积累更多脯氨酸。在干旱和低温胁迫过程中，植株SOD和POD酶活性总体呈上升趋势；在盐胁迫下，SOD和POD活性呈现先增加后降低的趋势。由于植物的生理指标变化通常滞后于基因表达，选择三种胁迫处理12h内的植株，提取RNA进行转录组测序。　　(2)利用HiSeq2000测序平台对黄花棘豆四个样本进行测序，共获得23.22G总数据并上传至NCBI BioProject（登录号：PRJNA292613）。经Trinity软件拼接组装后获得217，270个transcripts和118，596个unigenes，其中注释到植物物种中的unigenes有88，942个，与黄花棘豆亲缘关系较近的物种有鹰嘴豆、蒺藜苜蓿、大豆等。共10，465(11.76%)个基因注释到267条KEGG代谢通路。经过GO功能注释和KEGG代谢途径富集，三种胁迫下差异表达基因( DEGs)主要参与渗透调节、次生代谢、不饱和脂肪酸合成与代谢，植物激素合成及信号转导，氧化磷酸化、转录调控等途径。　　(3)在建立起黄花棘豆本地blast数据库的基础上，筛选12个候选内参基因，并检测候选基因在干旱、盐、低温胁迫下的表达模式，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对基因的表达稳定性进行评估。经综合分析，在三种胁迫处理的黄花棘豆样本中ACT7、HIS、ACTl01基因表达最稳定，18s、TUA、AC11，最不稳定。从DEGs中挑选30条unigenes进行qRT-PCR检测，其中24个unigenes在三种胁迫下的表达模式与转录组测序结果相符。　　(4)筛选黄花棘豆逆境响应功能熬因并鉴定其表达特征，包括逆境蛋白、次生代谢、转录因子、植物激素以及钙信号相关基因。在逆境蛋白中，起分子伴侣作用的OoLEA、OoDHN在三种胁迫下均显著上调表达；参与细胞壁组分合成的OoPRP、OoGS在干旱和盐胁迫中后期大量表达；参与植物防御反应的OoGLP在干旱胁迫下表达量最高；胁迫应激蛋白OoHSP70仅在盐胁迫下表达量上调。多个参与木质素及类黄酮合成途径的基因OoPAL、OoC4H、004CL、OoCHR、OoADH在三种胁迫过程中上调表达。转录因子相关基因中OoAREB与ABA信号通路有关；OoMYB快速应答低温胁迫；OoNAC早于其他转录因子表达；OoWRKY和OoERF与黄花棘豆的低温响应有关。在三种胁迫下黄花棘豆内源激素含量总体向着气孔关闭，根系伸长，抗性增强的趋势变化，多个抗逆激素ABA、ETH、JA合成及信号转导相关基因上调表达。在低温胁迫下多个钙信号相关基因表达量上调。　　(5)克隆黄花棘豆OoNCED和OoAREB基因编码区并进行生物信息学分析。OoNCED编码612个氨基酸，分子量为68.4kDa，等电点为8.18; OoAREB编码426个氨基酸，分子量为46.4 kDa，等电点为9.38。OoNCED和OoAREB编码蛋白整体表现为亲水性，不具有跨膜结构域和信号肽。OoNCED和OoAREB编码蛋白分别定位于叶绿体和细胞核中，二级结构主要是α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。通过序列同源性分析，黄花棘豆OoNCED和OoAREB氨基酸序列分别与柠条NCEDl (ACU86971.1)和AREB(ABG90380.1)亲缘关系最近。　　(6)研究干旱胁迫下黄花棘豆中内源信号分子NO的动态平衡以及与ABA的相互关系。PEG诱导黄花棘豆根尖中NO急剧增加，主要分布于根毛、根系皮层细胞和维管组织。在黄花棘豆植株各部位NO的米源不同，根尖中主要有非酶途径和NR途径，在整株中NOA途径也参与NO的合成。OoNR、OoNOA、OoGSNOR共同调节黄花棘豆中NO的平衡。由PEG诱导的根尖中NO积累是暂时的，H202含量随着NO水平降低而增加，NO和H202作为信号分子在一定范围内保持平衡。干旱胁迫条件下，黄花棘豆ABA含量增加，ABA合成抑制剂FLU加深植株脂质过氧化程度，证明黄花棘豆中依赖ABA的抗旱机制。另外，FLU抑制了干旱胁迫下NO的积累，而内源NO清除剂cPTIO不影响ABA含量变化，证明NO是ABA的下游信号。同时当NO清除后植株MDA含量显著增加，说明干旱胁迫下黄花棘豆内源NO参与依赖ABA的信号通路进而减轻植株氧化损伤和脂质过氧化程度。

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