聚合物/蛋白质核壳纳米粒子的合成及在葡萄糖传感器中的应用研究

摘要

本论文以“聚合物/蛋白质核壳纳米粒子的合成及在葡萄糖传感器中的应用研究”为主题，利用铜离子引发体系在蛋白上接枝聚合物，制备了壳层为蛋白的核壳纳米粒子；通过激光光散射(LLS)、透射电镜(TEM)、Zeta电位和X射线光电子能谱(XPS)等分析技术表征了粒子的核壳结构；通过带耗散的石英晶体微天平(QCM-D)和LLS研究了酶与壳层为蛋白的纳米粒子之间的相互作用以及酶在粒子上的吸附性质；利用壳层为蛋白的纳米粒子固定酶制备了生物传感器，并结合循环伏安法和恒电位安培法详细表征了生物传感器的测试性能。主要结果如下：
　　 首先，利用铜离子引发体系，我们制备出核层为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)壳层为牛血清白蛋白(BSA)的PMMA-BSA核壳纳米粒子。通过TEM表征，直接观察到了PMMA-BSA纳米粒子的核壳结构。Zeta电位实验表明粒子和BSA的Zeta电位随溶液pH值变化基本一致，说明粒子的壳层为BSA。结合XPS测试，对比分析了PMMA-BSA纳米粒子和BSA的表面成分，为PMMA-BSA纳米粒子的壳层是BSA提供了直接的证据。在实验上，我们研究了温度、BSA与MMA质量比和铜离子浓度对聚合反应的影响，并利用索氏提取和酸水解法，得到聚合生成的均聚PMMA(homo-PMMA)和接枝到BSA上的共聚PMMA(graft-PMMA)，通过分析它们的结构，来研究聚合反应的原理。结果表明铜离子介入的MMA在BSA上的接枝聚合属于自由基聚合反应，并表现出乳液聚合的特征。铜离子通过与BSA络合，在加热下发生氧化还原，产生自由基，引发MMA在BSA上的接枝聚合，产生的PMMA和BSA在水溶液中自组装形成PMMA-BSA核壳纳米粒子。通过控制聚合反应中BSA与MMA的质量比，我们可以制备出粒径分布较窄，半径范围在60-110nm的PMMA-BSA核壳纳米粒子。由于壳层为蛋白，使得PMMA-BSA纳米粒子具有良好的生物相容性。
　　 其次，研究了PMMA-BSA纳米粒子对葡萄糖氧化酶(GOx)的固定。在实验上，利用LLS和QCM-D表征方法，详细研究了GOx与PMMA-BSA纳米粒子之间的相互作用及GOx在PMMA-BSA纳米粒子上的吸附过程。结果表明，GOx是以静电吸引为驱动力吸附到PMMA-BSA纳米粒子上。当溶液pH值小于GOx等电点4.2或大于PMMA-BSA等电点5.1时，GOx和PMMA-BSA纳米粒子表面带同种电荷，静电排斥阻碍了GOx在粒子表面的吸附；当溶液pH值介于PMMA-BSA和GOx等电点之间时，GOx通过静电吸引固定到PMMA-BSA粒子表面。QCM-D实验结果表明GOx在PMMA-BSA纳米粒子上的吸附有两个动力学过程：第一个过程是由静电吸引作用导致的GOx在PMMA-BSA纳米粒子表面的快速吸附过程;第二个过程是由吸附在粒子上的GOx构象调整，产生了一些新的吸附位点，使GOx继续吸附的过程。利用紫外光谱法测试了吸附后GOx的活性，结果表明与自由GOx相比，吸附到PMMA-BSA纳米粒子上的GOx活性保留了80％以上。并且吸附后的GOx耐热性也获得很大提高。在50℃下恒温35小时之后，GOx自由酶的活性损失了64％，而吸附到粒子上的GOx仅损失了28％的活性。
　　 在这些实验基础上，我们利用PMMA-BSA纳米粒子固定GOx，制备了电流型葡萄糖传感器。通过循环伏安法和恒电位安培法，表征了传感器的测试性能。在氧气存在下，传感器对葡萄糖具有良好的催化作用，循环伏安实验表明传感器具有典型的扩散控制的电化学特征。在0.4 V的工作电位下，传感器对葡萄糖的线性响应范围为0.2-9.1 mM，灵敏度高达44.1μAmM-1cm-2，响应时间仅为6 s，并且传感器在0.25 V的低电位下，对葡萄糖仍具有较高的电流响应密度(25.8μAmM-1 cm-2)，表明传感器可以通过低电位工作降低干扰物的影响。在相同条件下制备的传感器，对1 mM葡萄糖的响应电流的相对标准偏差仅为4.9％;另外，传感器在含有1mM葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液(0.05 M，pH7.4)中，以50 mV/s的扫描速度在0-0.6 V的范围内扫描50圈，氧化电流未见明显减小，表明传感器具有良好的重现性和稳定性。我们还考察了传感器的储存稳定性，结果表明传感器在室温下储存23天响应电流仅下降4％，储存30天后，仍具有82％的响应电流。优异的操作稳定性和储存性能使得我们制备的传感器具有潜在的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：注释

声明

第一章绪论

1.1前言

1.2葡萄糖传感器的种类

1.3电流型葡萄糖酶传感器的研究进展

1.3.1第一代电流型葡萄糖酶传感器

1.3.2第二代电流型葡萄糖酶传感器

1.3.3第三代电流型葡萄糖酶传感器

1.4葡萄糖氧化酶的固定方法

1.4.1吸附法

1.4.2包埋法

1.4.3共价键合法

1.4.4交联法

1.5本论文研究工作

参考文献

第二章仪器原理

2.1激光光散射基本原理

2.1.1发展简史

2.1.2基本原理

2.1.3光散射装置

2.2石英晶体微天平

2.2.1发展简史

2.2.2基本原理

2.2.3 QCM-D仪器结构简介

参考文献

第三章 PMMA-BSA核壳纳米粒子的合成及聚合反应原理的研究

3.1引言

3.2研究概述

3.3实验部分

3.3.1试剂及纯化

3.3.2实验仪器

3.3.3样品的制备与表征

3.4结果与讨论

3.4.1 PMMA-BSA纳米粒子的结构分析

3.4.2聚合反应机理

3.4.3聚合反应条件的影响

3.5结论

参考文献

第四章葡萄糖氧化酶在PMMA-BSA核壳纳米粒子上吸附性质的研究

4.1引言

4.2研究概述

4.3实验部分

4.3.1试剂及纯化

4.3.2实验仪器

4.3.3样品的制备与表征

4.4结果与讨论

4.4.1吸附实验的LLS表征

4.4.2吸附实验的QCM-D和AFM表征

4.4.3吸附实验的定量分析结果

4.4.4 GOx吸附后的活性及耐热性表征

4.5结论

参考文献

第五章基于PMMA-BSA纳米粒子的葡萄糖传感器的制备及性能研究

5.1引言

5.2研究概述

5.3实验部分

5.3.1试剂及纯化

5.3.2实验仪器

5.3.3基于PMMA-BSA纳米粒子的电流型葡萄糖酶传感器的制备

5.4结果与讨论

5.4.1 Pt/PMMA-BSA～GOx/GA电极的电化学行为

5.4.2传感器工作电位的选择

5.4.3测试溶液中pH值的影响

5.4.4 GOx含量的影响

5.4.5传感器的性能测试

5.4.6传感器的重现性和稳定性

5.5结论

参考文献

致谢

攻读博士期间已发表和待发表的论文