聚磷酸酯纳米凝胶作为抗癌药物输送载体的研究

摘要

纳米凝胶具有一个亲水性交联网络结构的内核，已经被广泛应用于亲水性抗癌药物、蛋白分子、核酸类药物的输送。本论文的研究中，利用多种方法构建了基于聚磷酸酯的纳米凝胶，证明了这些纳米凝胶具有良好的生物相容性。这些纳米凝胶能高效负载抗癌药物阿霉素，并成功将药物分子输送到细胞内，其中具有肝靶向修饰的纳米凝胶在化学药物诱导的原发性大鼠肝癌的治疗中显示良好的效果。本文的研究分为以下4个部分：
　　 第一部分：我们制备了一系列基于聚磷酸酯和聚乙二醇的大分子单体，利用反相微乳液体系，通过氧化/还原自由基引发体系引发大分子单体聚合，获得了尺寸在250 nm左右的纳米凝胶。使用GPC、NMR、FT-IR对大分子单体的结构及组成进行了详细的分析，并通过动态光散射、TEM对纳米凝胶的分散及形态进行了研究。我们进一步将这种纳米凝胶作为载体，输送抗癌药物阿霉素，通过实验证明这种载体能高效负载阿霉素，并显著抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖。
　　 第二部分：我们充分利用高分子链段的特殊磷酸酯具有温度敏感性的特点，通过“无模板法”制备了具有交联内核的纳米凝胶。温度响应性的三嵌段聚合物PEEP151-PEG2000-PEEP151的二丙烯酸酯在温度高于它的最低临界溶解温度(LCST)时在水溶液中自组装成纳米颗粒，进一步将纳米颗粒进行交联固定后，在室温下形成一种内核亲水的纳米凝胶。我们通过流式细胞计数技术和共聚焦激光扫描显微镜等研究方法证实了负载阿霉素的纳米凝胶能够高效被人肺癌肿瘤细胞A549摄取，并在细胞内释放药物。与游离阿霉素分子相比，这种载药纳米凝胶能显著抑制A549肿瘤细胞的增殖。
　　 第三部分：我们通过“一步合成法”制备了一种具有聚乙二醇壳层及交联磷酸酯内核的纳米凝胶。这种纳米凝胶的表面键和了半乳糖配体，特异性被去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)所识别。我们将其作为肝靶向性的纳米载药体系输送阿霉素，用于肝癌全身性治疗。研究结果表明，这种带有半乳糖配体的纳米凝胶载体能特异性被HepG2肝癌细胞识别，并显著增强阿霉素在肝脏部位的累积。虽然与非靶向性的纳米凝胶载体相比，在体内分布上该纳米凝胶并未能体现其靶向能力的优势，但研究观察其负载的阿霉素在肝脏部位的累积方式时，发现靶向配体修饰的纳米凝胶载体显著提高肝实质细胞对其的摄取。不仅如此，这种靶向性载药纳米凝胶在二乙基亚硝胺诱导的Wistar大鼠原发性肝癌的治疗中显示了优越的抗肿瘤生成与发展的能力。
　　 此外，为了研究聚磷酸酯和细胞的相互作用，以及聚磷酸酯对细胞功能的影响，我们使用聚2-氨乙基丙烯基磷酸酯作为聚阳离子与其它聚电解质构建了表面为聚磷酸酯的层层自组装薄膜。我们将这种聚磷酸酯为表面的薄膜材料作为成骨细胞(osteoblast)的培养基质，研究了成骨细胞在薄膜表面的粘附、生长及增殖情况，检测了成骨细胞表型的表达，并对生长在这种聚磷酸酯薄膜材料上的成骨细胞功能进行了评价。实验结果发现这种薄膜不仅能促进成骨细胞的粘附，而且能显著增强成骨细胞的分化能力；同时通过检测生长在聚磷酸酯薄膜上的成骨细胞功能，发现其表型蛋白碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达量都明显高于培养在细胞培养板表面的成骨细胞，并且钙离子的沉积量也显著增加，证明了这种基于聚磷酸酯材料的薄膜能促进成骨细胞的分化。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1纳米生物技术

1.2纳米医药

1.2.1纳米医药在疾病诊断上的应用

1.2.2纳米医药在疾病治疗中的应用

1.3纳米凝胶

1.3.1纳米凝胶的制备方法

1.3.2纳米凝胶作为药物载体的应用

1.4聚磷酸酯材料在生物医学上的应用

1.5本课题的选题目的及主要研究内容

参考文献

第2章反相微乳液体系制备纳米凝胶及其作为药物输送载体的应用

2.1 引言

2.2实验材料及方法

2.2.1实验材料

2.2.2聚合物合成

2.2.3聚合物的表征

2.2.4纳米凝胶的制备

2.2.5纳米凝胶的表征

2.2.6纳米凝胶对阿霉素药物的包载及释放

2.2.7载药纳米凝胶对MCF-7细胞增殖活力的抑制实验

2.2.8数据分析

2.3实验结果

2.3.1大分子单体的合成与表征

2.3.2交联剂的合成与表征

2.3.3纳米凝胶的合成与表征

2.3.4纳米凝胶对抗癌药物阿霉素的包载及释放

2.3.5负载阿霉素的纳米凝胶对肿瘤细胞MCF-7增殖的抑制能力

2.4结论与讨论

参考文献

第3章无模板法构建温度敏感性纳米凝胶及其作为药物输送载体的研究

3.1 引言

3.2实验材料及方法

3.2.1 实验材料

3.2.2聚合物的合成

3.2.3聚合物的表征

3.2.4聚合物溶液透过率的检测

3.2.5纳米凝胶的制备

3.2.6聚合物自组装颗粒及纳米凝胶粒径的表征

3.2.7纳米凝胶的形貌观察

3.2.8纳米凝胶包载抗癌药物阿霉素

3.2.9阿霉素从载药纳米凝胶中的体外释放

3.2.10人肺癌细胞A549对载药纳米凝胶的吞噬行为

3.2.11 载药纳米凝胶抑制人肺癌细胞A549细胞增殖的活力

3.2.12数据分析

3.3实验结果

3.3.1 聚合物PEEP151-PEG2000-PEEP151 diacrylate的合成与表征

3.3.2聚合物的温度响应性

3.3.3温度敏感性纳米凝胶的制备与表征

3.3.4纳米凝胶对抗癌药物阿霉素的包载及释放

3.3.5人肺癌细胞A549对纳米凝胶的吞噬

3.3.6包载阿霉素纳米凝胶对人肺癌细胞A549增殖的抑制

3.4结论与讨论

参考文献

第4章肝靶向性纳米凝胶的制备及其输送阿霉素抑制原发性肝癌的研究

4.1 引言

4.2实验材料及方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 α羟基-ω-甲苯磺酰基-聚乙二醇(α-hydroxy-ω-tosyl poly(ethylene glycol)，HO-PEG3400-Tos)与α-羟基-ω-叠氮基-聚乙二醇(α-hydroxy-ω-azide poly(ethylene glycol)，HO-PEG3400-N3)的合成

4.2.3靶向性纳米凝胶(Gal-PPE)与非靶向性纳米凝胶(m-PPE)的制备

4.2.4聚合物及纳米凝胶的表征

4.2.5纳米凝胶对抗癌药物阿霉素的包载

4.2.6阿霉素从载药纳米凝胶中的释放行为

4.2.7人肝癌细胞HepG2对纳米凝胶的吞噬实验

4.2.8载药纳米凝胶抑制HepG2细胞增殖活力的实验

4.2.9 Wistar大鼠原发性肝癌模型的建立

4.2.10原发性肝癌治疗

4.2.11阿霉素的组织分布

4.2.12阿霉素在肝脏中的定位检测

4.2.13组织病理观察及免疫组织化学染色

4.2.14 Western blot检测肝组织中的蛋白表达

4.2.15数据分析

4.3实验结果

4.3.1官能化聚乙二醇的合成与表征

4.3.2纳米凝胶的合成与表征

4.3.3纳米凝胶对抗癌药物阿霉素的包载及释放

4.3.4官能化纳米凝胶对HepG2细胞的靶向能力

4.3.5载药纳米凝胶对HepG2细胞的生长抑制

4.3.6 Wistar大鼠原发性肝癌模型的建立

4.3.7体内分布

4.3.8阿霉素在肝脏组织中的定位

4.3.9包载阿霉素的靶向纳米凝胶对原发性肝癌的抑制能力

4.4结论与讨论

参考文献

第5章 基于聚磷酸酯的层层自组装薄膜作为成骨细胞生长基质的研究

5.1 引言

5.2实验材料及方法

5.2.1实验材料

5.2.2层层自组装薄膜PEI-(PSS/PAH)3-(PSS/PPE-EA)3的构建

5.2.3石英晶体微天平(QCM)跟踪聚电解质薄膜的沉积

5.2.4成骨细胞的提取

5.2.5成骨细胞粘附实验

5.2.6成骨细胞增殖实验

5.2.7碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的检测

5.2.8成骨细胞Ⅰ型胶原的检测

5.2.9钙离子含量检测

5.2.10层层自组装薄膜的生物相容性检测

5.2.11 数据分析

5.3 实验结果

5.3.1 石英晶体微天平(QCM)跟踪聚电解质薄膜的沉积

5.3.2成骨细胞在多层聚合物薄膜上的初始粘附能力

5.3.3成骨细胞在多层聚合物薄膜上的生长状态

5.3.4成骨细胞在多层聚合物薄膜上的增殖情况

5.3.5 成骨细胞蛋白含量检测

5.3.6成骨细胞的功能检测

5.3.7层层自组装薄膜对成骨细胞的毒性检测

5.4结论与讨论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果