MCM5基因的克隆和真核表达及其与P53相互作用的鉴定

摘要

P53 曾被称为“cellular gatekeeper”(Levine，1997)和“the guardian of the genome ”(Lane，1992)，因为它在协调和整合细胞对多种外界胁迫因子的应答过程中发挥了重要作用。P53像一个负责处理和整合信息然后发号施令的枢纽和控制中心，根据细胞面临的胁迫刺激的种类和刺激强度的差异，启动不同的下游信号通路，从而决定细胞的应答方式，即细胞凋亡，细胞周期阻滞，细胞衰老，DNA损伤修复，细胞代谢状态改变或发生自噬。
　　 不同的胁迫刺激条件可以使p53发生不同形式的翻译后修饰变化，进而引起一系列的细胞应答反应。P53蛋白包括了N端（氨基端）富含脯氨酸的转录激活结构域，DNA结合结构域，四聚化结构域和C端（羧基端）结构域。P53应答多种胁迫条件而进行的翻译后修饰主要发生在p53蛋白分子的N端。虽然p53的某些生物学效应与转录功能无关，但p53对其靶基因的转录激活是细胞应答各种胁迫刺激的一种非常重要的方式。而p53蛋白的氨基端不仅与其转录激活有关，还参与了p53与MDM2的相互作用。除MDM2外，还有很多p53相互作用蛋白都可以影响p53的稳定性。
　　 为了寻找新的可能调节p53转录激活的蛋白，利用包含了人源p53蛋白氨基端60个氨基酸的融合蛋白GST-p53N60与HeLa细胞裂解液进行GST pull-down实验，通过质谱分析获得了一个新的p53结合蛋白MCM5。MCM5作为一个DNA 复制调控蛋白，它是进化保守的真核细胞微小染色体维持蛋白家族成员之一。这个家族蛋白（MCM2-7）可以形成一个环形异源六聚体复合物，作为DNA 解旋酶参与DNA 复制的起始和延伸过程。以HeLa的cDNA文库作为模板进行PCR，获得了全长的人源MCM5基因。并将其克隆到了pEGFP-C1和 p3*flag-myc-CMV-24两个真核系统表达载体，并通过GST pull-down和免疫共沉淀实验进一步确证了p53可以和MCM2-7解旋酶复合物的调节亚基之一MCM5发生相互作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

第二章 实验材料与方法

第三章 结果与讨论

参考文献

致 谢