肝脏靶向性多功能载体的构建及其急性肝脏免疫损伤的基因治疗

摘要

肝脏作为人体最大的内脏器官，具有重要的消化和代谢功能，承担着分泌胆汁、参与糖、脂肪和蛋白质的代谢过程、分解代谢有毒物质的功能。它具有特殊的血液循环系统，能够接受来自门静脉和肝动脉的双重血液供应。肝小叶是肝脏的基本结构单位，肝细胞在其中呈放射状围绕中央静脉排列形成肝板结构，肝板之间是肝血窦。小于100nm的颗粒物可以高效的从血管中进入肝实质细胞。肝脏特殊的解剖学结构以及其重要的生理学功能，使得肝脏成为基因治疗理想的靶器官。
　　 随着分子和细胞生物学、病毒学和免疫学的不断发展，众多肝脏疾病的分子遗传发病机制得以解释，除传统的肝细胞移植外，针对众多遗传性或获得性肝脏疾病的基因治疗成为重要手段，具有广泛的应用前景。肝脏的基因治疗面临的最大难题是如何高效安全的将治疗基因导入肝细胞，并能够长期有效表达。因此，对应用于肝脏基因治疗的载体系统进行研究具有重大意义。基因治疗载体系统的选择，既要考虑基因传递的效率和特异性，治疗基因的表达时相，也需要考虑载体进入宿主后所引起的免疫反应以及载体所引起的副作用反应。理想化的肝脏基因治疗载体需要能够特异性的传递治疗基因到肝脏局部，能够实现在静息态的肝细胞中长期稳定表达治疗基因。载体本身必须无毒性和免疫原性，对载体的操作要简便易行，便于临床治疗的应用。目前，众多科研人员正针对多种病毒性载体（逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等）和非病毒载体（受体介导的载体、脂质体、纳米颗粒等等）进行研究和改进。
　　 本研究构建了一种新型的肝脏靶向性基因治疗载体，具有高效低毒长期有效等优点，并且能够针对多个目标基因进行调控。以此载体为模版，通过对多个目标基因的替换，可以应用于多种肝脏疾病的基因治疗研究。该载体能够通过非病毒载体或病毒载体导入到肝细胞，能够维持至少一个月的稳定保护作用。应用该肝脏靶向性多功能治疗载体，选择RNA干扰CCchemokineligand-5(CCL5)和Fractalkine(FKN)和同时过表达人白介素10(humaninterleukin-10，hulL-10)，验证了这三种基因的组合操作，可以有效预防和治疗高剂量腺病毒系统性感染或polyI∶C联合D-GalN注射所导致的、NK细胞介导的急性肝脏免疫损伤。由于各种肝脏疾病（例如恶性肿瘤和病毒性肝炎）通常与多个基因的调控紊乱相关，该研究提供了一种单个治疗载体、以肝细胞靶向性的方式同时调控多个靶基因，从而治疗肝脏疾病的方式，为肝脏疾病的免疫基因治疗提供一个实用有效的工具。
　　 1.肝细胞特异性多功能载体的构建及验证
　　 通过比较不同的增强子、启动子组合，最终优化组合了由甲胎蛋白增强子和白蛋白启动子组成的肝细胞特异性启动子。基于microRNA结构的第二代小干扰RNA(shRNAmir)的高效基因沉默，结合shRNAmir可以由肝特异性RNA聚合酶Ⅱ类启动子转录产生，构建了肝脏特异性基因治疗载体。内部核糖体进入位点序列(IRES)和shRNAmir被用来构建多功能载体，能够针对不同基因同时进行过表达和基因沉默。我们利用不同的报告基因进行了验证，所构建的肝细胞特异性多功能报告基因载体能在肝癌细胞系Huh7中特异性的过表达β-半乳糖苷酶编码基因LacZ和红色荧光蛋白DsRed2，同时针对绿色荧光蛋白EGFP和萤火虫荧光素酶FireflyLuciferase进行干扰。
　　 2.肝脏靶向性表达hulL-10并同时干扰CCL5和FKN能够有效抑制腺病毒引起的肝损伤
　　 我们实验室之前的研究结果发现，高压注射带有干扰FKN小干扰RNA的腺病毒载体，能够显著降低由腺病毒引起的NK细胞介导的急性肝脏损伤。鉴于单一趋化因子的干扰可能无法达到最佳效果，我们构建了可以操作多种功能基因的肝脏靶向性载体。我们的实验结果表明，与单独干扰FKN相比，联合干扰趋化因子FKN和CCL5能够进一步抑制淋巴细胞的浸润和炎性细胞因子的产生，降低肝脏中NK细胞的比例，减轻肝脏损伤;而干扰趋化因子FKN联合在肝脏中过表达抑制性细胞因子huIL-10，亦能进一步降低淋巴细胞的浸润及炎性细胞因子水平。肝脏损伤的减轻从病理水平上得到进一步的确认。因此我们利用肝脏靶向性多功能载体构建了能够同时表达huIL-10以及报告基因DsRed2，并能同时对CCL5和FKN进行基因沉默的多功能载体。这种含有8个功能片段协同作用的多功能载体可以降低肝脏NK细胞的数目和活性以及血清中炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平，从而显著降低由高剂量腺病毒感染所诱导的急性肝损伤。从血清转氨酶水平和病理结果上证明急性肝损伤被显著抑制。
　　 该肝脏靶向性多功能载体在高压注射到小鼠肝脏一个月之后，仍然能够高效抑制高剂量腺病毒系统性感染诱导的急性肝损伤，其保护作用具有长期性;此外，这种肝脏靶向性多功能载体不仅可以通过质粒高压注射的方式导入肝脏，也可以借助于嗜肝性感染的腺病毒载体导入。当这种肝脏靶向性的多功能载体包装成腺病毒载体，并且与普通复制缺陷型腺病毒混合以高剂量系统性进行感染小鼠时，能够显著抑制腺病毒诱导的急性肝损伤，肝脏淋巴细胞浸润减少，炎性细胞因子水平降低。
　　 3.肝脏靶向性多功能载体抑制PolyI∶C/D-GalN注射诱导的急性肝损伤
　　 D-GalN作为肝脏致敏剂广泛用于多种动物模型，PolyI∶C可以模拟病毒RNA引起机体免疫应答。实验室之前的研究结果证明PolyI∶C和D-GaIN联合注射会诱发严重的急性肝损伤，这种损伤主要通过Kupffer细胞和NK细胞介导。因此，我们将所构建的能够肝脏靶向性表达huIL-10并同时干扰CCL5和FKN的多功能载体预先注射小鼠，发现能够显著抑制肝脏淋巴细胞的浸润，降低肝脏NK细胞的比例，血清中炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α也显著降低。病理组织切片显示，与对照组相比，肝脏靶向性多能载体处理组无明显的肝组织坏死。

目录

声明

摘要

符号说明

图序

表序

第一章 绪论 靶向肝脏的基因治疗

1．1 肝脏基因治疗概述

1．1．1 肝脏基因治疗的概念

1．1．2 肝脏基因治疗的策略

1．1．3 肝脏基因治疗的疾病应用

1．1．4 肝脏基因治疗需要考虑的关键问题

1．1．5 肝脏基因治疗的前景与展望

1．2 肝脏的靶向基因治疗技术

1．2．1 肝脏基因治疗的载体系统

1．2．2 靶向肝细胞定位表达的基因治疗载体

1．2．3 RNA干扰技术在肝脏靶向基因治疗中的应用

1．2．4 多功能基因治疗载体的发展和改进

1．2．5 肝脏基因治疗的候选基因靶点

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 细胞及培养试剂材料

2．1．3 质粒

2．1．4 质粒制备抽提试剂盒

2．1．5 载体构建相关材料及试剂

2．1．6 病毒载体构建及病毒制备试剂

2．1．7 真核转染试剂

2．1．8 荧光素酶报告基因检测试剂

2．1．9 小鼠肝实质细胞分离相关试剂和材料

2．1．10 小鼠单个核细胞分离相关试剂和材料

2．1．11 流式细胞术检测抗体

2．1．12 血清谷丙转氨酶(ALT)检测试剂

2．1．13 肝组织病理切片及苏木素-伊红染色试剂

2．1．14 细胞因子ELISA检测试剂盒

2．1．15 X-Gal染色检测bacterial galactosidase (LacZ)活性

2．1．16 RT-PCR及real-time qPCR试剂

2．1．17 其他试剂及材料

2．2 实验仪器及设备

2．2．1 小鼠手术器械

2．2．2 小鼠肝实质细胞、淋巴细胞分离器械

2．2．3 细胞培养仪器设备

2．2．4 流式细胞仪

2．2．5 病理切片仪器设备

2．2．6 分子克隆仪器设备

2．2．7 其他仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 载体构建及分子克隆

2．3．2 真核细胞的转染

2．3．3 真核贴壁细胞的复苏、培养与冻存

2．3．4 细胞计数

2．3．5 复制缺陷型腺病毒载体质粒构建、包装及扩增纯化重组腺病毒

2．3．6 高压尾静脉注射

2．3．7 冰冻切片技术

2．3．8 荧光素酶报告基因检测

2．3．9 X-Gal染色检测bacterial galactosidase (LacZ)活性

2．3．10 小动物成像系统观察腺病毒体内感染

2．3．11 血清转氨酶ALT测定(赖氏法)

2．3．12 ELISA测定细胞因子

2．3．13 肝组织病理切片及H-E染色

2．3．14 小鼠肝实质细胞分离

2．3．15 小鼠单个核细胞分离

2．3．16 FACS检测细胞表面标志

2．3．17 小鼠急性肝损伤模型(腺病毒感染、Poly I：C／D-GalN注射)

2．3．18 统计学分析

第三章 结果与讨论

3．1 引言

3．2 肝细胞特异性多功能载体的构建与验证

3．2．1 肝细胞特异性启动子的选择

3．2．2 肝细胞特异性启动子与CMV启动子的比较

3．2．3 肝细胞特异性RNA干扰的实现

3．2．4 肝细胞特异性多功能载体的构建与验证

3．3 肝脏靶向性多功能载体有效抑制腺病毒引起的肝脏损伤

3．3．1 高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤

3．3．2 联合干扰FKN和CCL5有效抑制高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤

3．3．3 联合干扰FKN和表达huIL-10有效抑制高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤

3．3．4 同时干扰FKN／CCL5、表达huIL-10高效抑制高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤

3．3．5 肝脏靶向性多功能载体在腺病毒诱导急性肝损伤模型中的功能验证

3．3．6 肝脏靶向性多功能载体高效抑制高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤

3．3．7 肝脏靶向性多功能载体能维持长期的保护效果

3．3．8 肝脏靶向性多功能载体能通过腺病毒进行功能传递

3．4 肝脏靶向性多功能载体抑制Poly I：C／D-GalN诱导的急性肝损伤

3．4．1 肝脏靶向性多功能载体在poly I：C／D-GalN诱导急性肝损伤模型中的功能验证

3．4．2 肝脏靶向性多功能载体高效抑制Poly I：C／D-GalN诱导的急性肝损伤

3．5 讨论

3．5．1 肝脏靶向性基因治疗载体的研究进展

3．5．2 基于microRNA结构的第二代RNA干扰载体

3．5．3 肝脏靶向性多功能载体在肝脏疾病中的优势

3．5．4 肝脏基因治疗的前景与展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间的主要研究成果

发表和拟发表学术论文情况

发明专利

攻读博士学位期间参加参加学术会议

攻读博士学位期间所获得奖励