靶向性双自杀基因治疗载体的构建及其对大肠癌细胞的杀伤作用

摘要

目的： 构建由癌胚抗原启动子(CEA promoter，Cp)驱动的双自杀基因CD-TK治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK，研究癌胚抗原启动子能否控制CD-TK基因在CEA阳性大肠癌细胞中专一性表达和杀伤，比较融合基因与单基因对肿瘤细胞生长抑制方面有无差异，是否存在协同效应，并确定安全有效的药物使用浓度。观察旁观者效应。 方法： 分别以提取的人血细胞基因组DNA，pMD18-CD质粒和tgCMV/Hy-TK质粒为模板，PCR扩增Cp、CD和TK基因片段，采用双酶切、连接等方法依次将Cp、CD、TK基因亚克隆到载体pcDNA3.1(-)，构建含Cp启动子和CD-TK融合基因的载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK。 将靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK通过脂质体介导的方法分别转染CEA阳性的人大肠癌SW480细胞和CEA阴性的Hela细胞，采用RT-PCR检测在CEA启动子的调控下CD-TK融合基因分别在CEA阳性的人大肠癌SW480细胞和CEA阴性的Hela细胞的表达情况。并通过MTT法测定给予药物作用后双自杀基因对SW480细胞和Hela细胞的杀伤效应，以观察由CEA启动子驱动的CD-TK基因在CEA阳性细胞和阴性细胞中的细胞毒作用。 单独或联合给药GCV和/或5-Fc，在不同浓度的药物作用后，MTT法测定双自杀基因对SW480细胞的体外杀伤效应，比较融合基因与单基因对肿瘤细胞生长抑制方面有无差异，是否存在协同效应，并确定安全有效的药物使用浓度。以不同比例混合转染与未转染细胞，加药处理，用MTT法检测药物对SW480细胞的抑制率，以观察旁观者效应。 结果： 1.519bp的Cp基因片段、1310bp的CD基因片段、1129bp的TK基因均克隆正确。 2.靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK经凝胶电泳和DNA测序证实构建正确。 3.转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480细胞经过RT-PCR鉴定证实有CD-TK基因的表达，CEA阴性Hela细胞则没有CD-TK基因的表达。 4.在细胞培养试验中，转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-cD-TK的SW480细胞对前药5-Fc和GCV敏感。单独用前体药物处理转染载体的细胞SW480，在GCV，5-Fc浓度分别为1μg/mL，160μg/mL时，对SW480细胞的生长抑制率分别为32.33％和31.54％(P<0.01)。二者联合使用对SW480细胞的生长抑制效果更为显著，生长抑制率达60.70％(P<0.01)。 5.用前体药物处理部分转染的SW480细胞可见旁观者效应，当转染与未转染的SW480细胞的混合比例为50％时，即表现出显著的旁观者效应。而联合用药的旁观者效应较单独用药则更为明显(39.28％，P<0.01)。 结论： 正确构建了靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK。CEA启动子能控制CD-TK基因在CEA阳性大肠癌细胞中专一性表达和杀伤。联合应用CD/5-Fc和HSV-TK/GCV系统的肿瘤杀伤效应比单独应用CD/5-Fc或HSV-TK/GCV强。同时显示较强的旁观者效应。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

材料和方法

1主要材料

1.1质粒及细菌菌株

1.2细胞株及血清

1.3主要试剂

1.4主要仪器

1.5主要溶液的配制

2方法

2.1 pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK设计与构建

2.2 pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK质粒转染SW480细胞和Hela细胞

2.3 RT-PCR鉴定转染后SW480细胞和Hela细胞中CD／TK基因表达

2.4 MTT法测定细胞生长抑制率

2.5旁观者效应

2.6数据处理

结 果

1表达载体的构建、鉴定与序列分析

1.1 PCR扩增Cp、CD、TK基因的凝胶电泳鉴定

1.2 pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的酶切鉴定

1.3重组质粒的测序结果分析

2最适质粒与转染试剂浓度比的确定

3 RT-PCR鉴定转染后SW480细胞和Hela细胞中CD／TK基因表达

4前体药物对细胞的毒性作用

4.1前药GCV对细胞的杀伤效果以及最适用药浓度的确定

4.2前药5-Fc对细胞的杀伤效果以及最适用药浓度的确定

4.3联合用药对细胞的杀伤效果以及最适用药浓度的确定

4.4不同浓度的前药对两种细胞的杀伤效应

5旁观者效应

讨论

结 论

参考文献

综述大肠癌靶向性基因治疗研究进展

致谢