单组分纳米材料在癌症诊断和细胞自噬介导的癌症治疗中的应用研究

摘要

癌症作为一种难以彻底治愈的疾病，在现代医学飞速发展的今天，依旧严重威胁着人类的健康和生命。通过可控合成而具备理想尺寸、形貌和电荷性质的多种无机和有机纳米材料拥有宏观材料所不具备的，在肿瘤部位的渗透增强和滞留效应(EPR效应)。因此，新型的多功能纳米材料有望借此效应，并通过被动靶向聚集在肿瘤部位的方式成为诊断和治疗癌症的有效工具。近年来，关于设计并合成多组分的磁性纳米材料以实现核磁共振靶向药物输运的研究已取得很多进展。此外，磁性纳米材料还被证明可以与介孔硅、贵金属、碳基材料以及荧光基团等成分偶联进而更有效地行使功能。然而，多组分的复合纳米材料与单组分材料相比，其核磁共振造影成像及肿瘤杀伤能力均会因为各组分间的相互干扰甚至拮抗而受到削弱。因此，探寻新型的单组分多功能纳米材料，并使其在具有良好核磁共振成像能力的基础上实现对癌细胞的高效杀伤，成为当今纳米科技全新的发展方向。如今，纳米科学与传统的肿瘤分子生物学以及药学的交互发展，使得“纳米生物学”这一全新的交叉学科应运而生。这一学科的诞生和发展也必将为单组分、多功能的纳米材料最终用于癌症的一体化诊疗提供更充实的理论依据。
　　 细胞自噬是真核细胞中特有的，进化上高度保守的机体防御和保护机制。细胞自噬受到多个关键分子的协同调控，具体是指细胞利用溶酶体降解长寿命蛋白以及自身受损细胞器等大分子物质的动态过程。由于细胞自噬与生物体的发育、分化、内稳态维持等多个关键的生理学以及细胞损伤、神经退行性疾病、肿瘤发生等病理学过程都紧密相关，因此受到越来越多的关注。近些年来，已经有多项研究发现纳米材料可以在癌细胞中诱导自噬的发生，也因此为癌症治疗提供了全新的思路。在本论文中，我们检测了两种单组分纳米材料，即水溶性、单分散性氧化锰纳米晶体以及富勒烯衍生物纳米晶体的自噬诱导能力。此外，我们还对两种纳米晶体通过诱导自噬进而增强癌细胞对化疗药物敏感性的效应和机理进行了深入的研究。
　　 在第一部分，我们在多元醇体系中使用微波辅助一步法高效而快速合成出了水溶性、单分散的氧化锰纳米颗粒。之后，我们证明了氧化锰纳米晶体可被癌细胞高效摄取并具有良好的核磁共振造影成像能力。此外，我们通过系统的研究手段证明了氧化锰纳米晶体可在多种癌细胞中诱导p53转录激活非依赖的细胞自噬。接下来，我们证实了氧化锰纳米晶体诱导细胞自噬的机理是通过增多自噬体的合成。更为重要的是，我们分别在细胞和动物水平证实了氧化锰纳米晶体可通过诱导细胞自噬并与低剂量的化疗药物阿霉素联用，增强癌细胞对化疗药物的敏感性。综上所述，我们合成出的氧化锰纳米晶体既具有核磁共振成像的诊断能力，又具有自噬介导的肿瘤杀伤能力，因此有望实现对多种癌症的“一体化诊疗”。
　　 在第二部分，我们证明了水分散性的富勒烯C60的衍生物C60(Nd)纳米晶体较C60有着更强的自噬诱导能力，以及利用自噬调节促进化疗药物对一般或耐药性癌细胞靶向杀伤的能力，该项研究成果同样可能为癌症的化疗方案选择提供全新的理论依据。

目录

声明

摘要

第1章 绪论(纳米材料及其在癌症诊断和治疗中的应用)

1．1 纳米材料

1．1．1 纳米材料的定义

1．1．2 纳米材料的独特性质

1．1．3 纳米科技的发展史

1．2 纳米材料在癌症诊断和治疗中的应用

1．2．1 癌症仍是威胁人类健康的重大疾病

1．2．2 实现癌症的早期诊断和靶向治疗面临严峻挑战

1．2．3 癌症纳米技术已成为实现癌症早期诊断和靶向治疗的一门新兴技术

1．3 展望

1．4 本论文的选题思路及研究内容

1．4．1 可实现对癌症“诊疗一体”的纳米材料是理想的生物医用纳米材料

1．4．2 单组分、多功能纳米颗粒是理想的用于癌症诊疗的生物医用纳米材料

1．4．3 单组分的氧化锰(MnO)纳米晶体是理想的T1型核磁共振造影剂

1．4．4 微波法是合成MnO纳米晶体的理想方法

1．4．5 提高癌细胞对化疗药物的敏感性成为癌症治疗的发展趋势

1．4．6 本论文的主要研究内容及意义

第2章 微波法合成的氧化锰纳米晶体诱导细胞自噬发生及其通过核磁共振造影及细胞自噬实现对癌症诊疗一体化的效应与机理研究

2．1 引言

2．1．1 细胞自噬的定义

2．1．2 细胞自噬研究的发展历程

2．1．3 细胞自噬的分类

2．1．4 细胞自噬的发生过程及自噬体形成的分子机制

2．1．5 细胞自噬的信号通路调控

2．1．6 自噬的生理学与病理学意义

2．1．7 细胞自噬的检测方法

2．1．8 纳米材料与细胞自噬

2．1．9 总结与展望

2．2 实验材料

2．2．1 生化试剂

2．2．2 抗体

2．2．3 显影试剂

2．2．4 质粒

2．2．5 细胞系与细胞株

2．2．6 实验动物

2．2．7 实验仪器

2．2．8 实验耗材

2．3 实验方法

2．3．1 PVP包裹的水溶性MnO纳米晶体的微波辅助合成

2．3．2 纳米材料理化性质表征

2．3．3 核磁共振成像(MRI)

2．3．4 细胞培养

2．3．5 建立稳定转染的GFP-LC3／HeLa(HeLa-LC3)细胞

2．3．6 GFP-LC3阳性细胞的计数

2．3．7 细胞自噬标记物染色

2．3．8 透射电子显微镜观察自噬泡

2．3．9 Westem Blot实验

2．3．10 细胞死亡测定

2．3．11 细胞活力测定

2．3．12 siRNA转染

2．3．13 S180肿瘤模型的建立

2．3．14 实验数据分析

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 水溶性氧化锰(MnO)纳米晶体的制备与鉴定

2．4．2 MnO纳米晶体具有良好的磁学性能

2．4．3 MnO纳米晶体具有良好的核磁共振成像能力

2．4．4 MnO纳米晶体可被癌细胞摄取并产生良好的核磁共振成像效果

2．4．5 MnO纳米晶体在癌细胞中具有良好的核磁共振成像效果

2．4．6 MnO纳米晶体具有较好的生物相容性

2．4．7 MnO纳米晶体可引起GFP-LC3的荧光点状聚集

2．4．8 MnO纳米晶体可引起内源性LC3的荧光点状聚集

2．4．9 MnO纳米晶体引起的GFP-LC3荧光点可与溶酶体共定位

2．4．10 MnO纳米晶体可诱导自噬泡产生

2．4．11 MnO纳米晶体可在HeLa细胞中引起LC3-Ⅱ型蛋白的积累

2．4．12 MnO纳米晶体引起LC3-Ⅱ型蛋白积累的能力强于Feridex

2．4．13 MnO纳米晶体可在HeLa细胞中诱导自噬体的合成

2．4．14 MnO纳米晶体可在HepG2及HaCaT细胞中诱导自噬体的合成

2．4．15 MnO纳米晶体可在HeLa-LC3细胞中引起游离GFP的释放

2．4．16 MnO纳米晶体诱导的细胞自噬不依赖于p53的转录激活

2．4．17 调控MnO纳米晶体诱导的细胞自噬可提高其生物相窖性

2．4．18 MnO纳米晶体诱导的细胞自噬可增强癌细胞对低剂量化疗药物的敏感性

2．4．19 MnO纳米晶体与阿霉素联用可协同抑制S180肉瘤的生长

2．4．20 自噬和凋亡均参与MnO纳米晶体增强癌细胞对化疗药物敏感性效应的产生

2．5 总结与讨论

第3章 富勒烯衍生物纳米C60(Nd)引起的细胞自噬及辅助化疗药物治疗癌症的研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 生化试剂

3．2．2 细胞系和细胞株

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 纳米C60／C60(Nd)的制备与鉴定

3．3．2 建立阿霉素抗性的人乳腺癌细胞系MCF-Dox细胞

3．3．3 活性氧(ROS)检测

3．3．4 细胞死亡的流式细胞仪测定

3．3．5 原代MEF细胞的分离与培养

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 纳米C60(Nd)的制备与鉴定

3．4．2 纳米C60(Nd)杀伤HeLa细胞及Dox抗性的MCF-7细胞的剂量和时间效应

3．4．3 纳米C60(Nd)可在癌细胞中诱导更强的自噬效应

3．4．4 纳米C60(Nd)可对癌细胞产生更显著的化疗增敏作用

3．4．5 纳米C60(Nd)引起的细胞自噬依赖于活性氧(ROS)的产生

3．4．6 纳米C60(Nd)的化疗增敏效应依赖于细胞自噬

3．4．7 纳米C60(Nd)在正常细胞中导致的损伤显著低于其在癌细胞中介导的化疗杀伤

3．5 总结与讨论

参考文献

致谢

缩略语

附录

攻读博士学位期间已发表和待发表的学术论文的学术论文

攻读博士学位期间已申请和正在申请的发明专利

攻读博士学位期间所获得的学术奖励

攻读博士学位期间所参加的学术会议

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