我国鼠诺如病毒的分离培养及其基因组序列分析和人诺如病毒感染性克隆的鉴定

摘要

目的:　　（1）分离我国实验小鼠中鼠诺如病毒（SH1603株），并进行基因组序列测定和分析。　　（2）为实现体外获得有感染性的人诺如病毒，本文对已构建的人诺如病毒感染性克隆进行了验证。　　方法:　　（1）利用RAW264.7细胞接种病毒，分离鼠诺如病毒SH1603，参照国外已发表的MNV4（DQ223043）基因组序列设计引物，经过重叠的反转录PCR扩增全基因组，利用生物信息学软件对全基因组序列进行分析。　　（2）将本实验室前期构建的人诺如病毒重组质粒转染BHK-T7细胞，通过免疫印迹（Western Blotting）检测诺如病毒衣壳蛋白的表达，采用Real-time PCR检测病毒基因组RNA的复制情况。　　结果:　　（1）鼠诺如病毒株SH1603引起RAW264.7细胞的病变，其基因组全长近7238个核苷酸，包括4个开放阅读框(Open Reading Frames,ORFs)，预测的ORF1、ORF2、ORF3、ORF4编码蛋白大小分别为186KD，58KD，22KD，23KD，其中ORF1和ORF2之间有14个核苷酸重叠，ORF2和ORF3之间有1个核苷酸重叠，ORF4包含在ORF2中。NCBI Blast比对发现SH1603基因组与MNV4同源性最高（94%）。衣壳蛋白区的进化分析发现SH1603与鼠诺如病毒MNV4（DQ223043）和Berlin0606（EF531291）亲缘关系最近。衣壳蛋白区氨基酸比对发现SH1603与MNV4有四个位点突变，分别是：aa211S→A，aa358I→V，aa404E→L，aa534V→A。　　（2）人诺如病毒感染性克隆重组质粒转染BHK-T7细胞后观察到轻微的细胞病变；Western blotting检测到诺如病毒衣壳蛋白VP1的表达；Real-time PCR的结果显示转染后人诺如病毒RNA量显著增加，且与转染后时间成正相关。　　结论:　　（1）我国实验小鼠携带有同国外报道的MNV4具有高度同源性的鼠诺如病毒，为我国相关鼠诺如病毒的研究奠定了基础。　　（2）本实验室构建的人诺如病毒感染性克隆在BHK-T7细胞中能够增殖和表达，为深入研究人诺如病毒的致病机制提供了工具。

目录

声明

前言

第一节 鼠诺如病毒SH1603的培养分离及其基因组的分析

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第二节 人诺如病毒感染性克隆的鉴定

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述:诺如病毒与鼠诺如病毒感染免疫研究进展

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