自组装纳米荧光探针用于caspase-3的检测

摘要

半胱氨酸蛋白酶是生物细胞体内广泛存在的具有着类似结构的蛋白酶，他们的活性位点普遍包含半胱氨酸，由于可以特异性地剪切天冬氨酸残基，也被称为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，简称caspase。Caspase是细胞凋亡过程中的主要效应子之一，在诸如阿兹海默症等多种疾病的检测中扮演重要角色，且在不同肿瘤细胞组织、不同细胞凋亡阶段中起到不同的作用、表达不同的浓度。目前研究较多的caspase-3可以特异性切割肿瘤细胞中的天冬氨酸一谷氨酸一缬氨酸．天冬氨酸(DVED)序列，在蛋白酶切割中处在核心位置。对于caspase-3的活性检测，可以帮助我们认知肿瘤细胞的生长过程，为其诊断以及靶向治疗提供有效手段。
　　自组装是化学、生物界普遍存在的一种小分子聚集成大分子甚至超分子的过程，比如动植物细胞的细胞膜以及DNA的双螺旋结构。在自组装的过程中，发生的并不是大量原子、分子之间弱作用力的简单叠加，而是基于非共价键的相互作用下，基本结构单元自发的组织或聚集为稳定、具有一定规则几何外观的结构。传统的由蛋白酶控制的自组装反应需要高浓度的反应底物或蛋白酶的使用，才能使小分子在酶的剪切作用下通过π-π键、氢键等方式自组装形成超分子。而近期发现的依靠CBT的氰基和半胱氨酸的1，2一氨基硫醇产生的缩合反应，可以通过仅仅几个单位的caspase-3酶完成剪切，并通过pH或者还原剂等条件进行控制反应。而缩合产物由于亲脂性发生变化，并且存在二级反应，故而会自组装形成纳米粒子，如果在反应物上连接正确的荧光基团，便会带来化合物荧光强度等多种化学性质的变化，这为我们测量低浓度下的caspase-3酶的含量提供了有力的工具。
　　本研究参考近期发现的caspase-3剪切诱导发生的高效缩合反应，设计了化合物Ac-Asp-Glu-Val-Asp-Cys(StBu)-Lys(FITC)-CBT(1)，通过三(2-羧乙基)膦(TCEP)的还原以及caspase-3的特异性识别剪切后发生缩合反应，其二聚体产物亲脂亲水性发生变化，自组装形成纳米粒子，并由于聚集荧光淬灭效应导致荧光强度较反应前大幅降低，从而实现caspase-3的检测。
　　反应生成的纳米粒子通过高效液相色谱、动态光散射仪以及透射电镜等手段进行表征，表明化合物1可以在低摩尔浓度下由几个单位的蛋白酶成功剪切缩合并自组装成纳米荧光探针，其荧光强度降低幅度与酶的含量在一定范围内成线性关系，可用于caspase-3酶在低浓度下的检测。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 分子影像学技术

1．1．1 核素成像

1．1．2 核磁共振成像

1．1．3 光学分子成像

1．2 荧光分子探针

1．2．1 荧光分子探针简介

1．2．2 荧光分子探针原理

1．3 半胱氨酸蛋白酶

1．4 点击反应以及其应用

1．5 论文研究对象以及设计思路

参考文献

第2章 Caspase-3荧光探针的合成与表征

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验装置与试剂

2．2．2 化合物合成

2．3 本章小结

参考文献

第3章 Caspase-3自组装纳米荧光探针的应用

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 荧光探针与caspase-3的缩合

3．2．2 纳米粒子表征

3．2．3 荧光探针对caspase-3的检测

3．3 本章小结

参考文献

致谢

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