家蚕微粒子病免疫学快速检测试纸条的研制

摘要

微孢子虫(microsporidia)是普遍分布于自然界的一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物，它们广泛寄生于脊椎动物和无脊椎动物中，是经济昆虫、鱼、兔、产毛动物、啮齿类及灵长类的常见病原。现在已报道的约有150个属、1400余种。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)主要寄生于经济昆虫家蚕，可通过胚胎向下代垂直传播，引发的家蚕微粒子病是蚕业生产上的毁灭性病害，被列为养蚕国家或地区蚕业生产的法定检疫对象。我国蚕业每年因微粒子病和带毒种而造成的直接经济损失高达上千万元。因此如何能够在家蚕发病的早期诊断并及时采取应对措施，以使损失降到最低是亟待解决的问题。虽然目前已经报道了一些比较有效的检测方法，这些方法虽然有各自的优点但也都存在着一定的问题，光学镜检虽然比较可靠、方便，但费时、费力，对操作人员的经验、技术要求较高。分子生物学检测技术主要是以PCR为基础，该方法对人员的仪器及实验技术要求较高，且时间较长，很难在蚕业生产上推广。因此，研制一种快速、简便、高效又能够在蚕业生产上广泛使用的检测方法已迫在眉睫。 虽然试纸检测技术已得到了广泛开展，但是用于家蚕微粒子病的快速检测试纸条的研制尚未见报道。本研究旨在通过研制家蚕微孢子虫的单克隆抗体，研制出一种能够快速检测家蚕微孢子虫的试纸条，以期能够灵敏、准确的诊断家蚕微粒子病，以便及早采取防治措施使损失降到最低，为蚕业生产提供一定的帮助，并方便在蚕业生产上推广和应用。主要研究结果如下： 1.家蚕微孢子虫发芽液蛋白的制备及动物的免疫 首先采用差速离心和Percoll梯度密度离心纯化家蚕微孢子虫，并采用吉姆萨染色法确定家蚕微孢子虫的纯度。通过碳酸钾发芽法制备家蚕微孢子虫的发芽液抗原，经SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，发现蛋白质条带较为丰富，浓度较高，适合免疫试验要求。将发芽液抗原分别以100μg/只和500μg/只的免疫剂量免疫BALB/c小鼠和兔子，以期获得高效价、特异的抗血清。间接ELISA法测定血清效价.选取效价小于1:1.6×103小鼠作为备用小鼠，超免用于细胞融合。 2.家蚕微孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定 取4次免疫小鼠的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞，用PEG-1500进行细胞融合，第一次融合率为99％，2次亚克隆后获得5株杂交瘤，经多次传代、冻存及复苏，筛选出分泌抗体稳定的杂交瘤细胞1株，命名为1F3；第二次融合率为100％，3次亚克隆后获得5株杂交瘤，经多次传代、冻存及复苏，筛选出分泌抗体稳定的杂交瘤细胞3株，分别命名为F10、G9、G10。四株杂交瘤细胞用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，间接ELISA鉴定其效价分别为1：6.4×105、1：6.4×105、1：1.28×106、1：2.56×106。经SIGMA公司的小鼠McAb亚型检测试剂盒测得1F3、F10、G9、G10同种型均为IgG1。然后，采用蛋白印迹(Wegern blot)和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence test，IFAT)两种方法对单抗特异性进行了鉴定，Wegern blot分析显示，单抗F10和G9均识别分子量约为31kDa蛋白质条带，所制备的单抗的IFAT结果显示，家蚕微孢子虫外壁发出明亮的翠绿色荧光，并且于发芽的家蚕微孢子虫空壳也呈现同样的荧光，说明抗体可能与家蚕微孢子虫的一种或几种孢壁蛋白发生反应。该实验表明所制备和筛选的家蚕微孢子的单克隆抗体可能是针对于家蚕微孢子虫的孢壁蛋白，可用于下一步的检测试纸条的试验。 3.家蚕微孢子虫快速检测试纸条的研制 利用酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析试验(GICA)原理组装了家蚕微孢子虫的快速检测试剂条，将胶体金标记技术与膜层析技术相结合应用于病原微生物的检测。经一系列实验组装了两种试纸条，均采用胶体金标记单抗G9，对照线上喷兔抗鼠IgG，而检测线采用不同处理，一种是检测线上喷兔多抗，另一种是喷单抗F10。并用发芽液抗原和感染家蚕微孢子虫的家蚕研磨液检验试纸条的敏感性，结果表示，两种试纸条均能特异的检测到发芽液中的抗原，但对研磨液中微孢子虫不敏感，需要更进一步的进行实验条件的优化与提高，才能用于家蚕微粒子病的生产检测。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1概述

1.2微孢子虫的分类与进化地位研究

1.3微孢子虫的生物学特征研究

1.3.1微孢子虫的超微结构

1.3.2微孢子虫的生殖圈和生活史特征

1.3.3微孢子虫侵染机制的研究

1.3.4微孢子虫与宿主相互作用的研究

1.4家蚕微孢子虫诊断方法的研究进展

第2章 引言

2.1研究背景与目的意义

2.2研究内容

2.3研究技术路线

第3章 家蚕微孢子虫发芽液蛋白的制备及动物免疫

3.1材料

3.1.1实验材料

3.1.2仪器设备

3.1.3实验试剂

3.1.4实验动物

3.2方法

3.2.1家蚕微孢子虫的提取与纯化

3.2.2家蚕微孢子虫发芽液蛋白的制备

3.2.3动物的免疫

3.3结果与分析

3.3.1 Giemsa染色观察家蚕微孢子虫

3.3.2 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定发芽液蛋白

3.3.3多抗血清效价测定

3.4讨论

第4章 家蚕微孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

4.1材料

4.1.1实验动物及细胞

4.1.2仪器设备

4.1.3实验试剂

4.2方法

4.2.1杂交瘤细胞株的建立

4.2.2单克隆抗体的生产

4.2.3单克隆抗体的鉴定

4.3结果与分析

4.3.1腹水及细胞培养上清McAb的效价

4.3.2亚类鉴定

4.3.3 WESTERN BLOT结果

4.3.4间接免疫荧光试验(IFAT)

4.4讨论

第5章 家蚕微孢子虫快速检测试纸条的研制

5.1材料

5.1.1仪器设备

5.1.2实验试剂

5.2方法

5.2.1胶体金的制备

5.2.2金标抗体的制备

5.2.3金标抗体玻璃纤维棉的制备

5.2.4 NC印膜的制备

5.2.5检测试纸的组装

5.3结果与分析

5.3.1试纸条检测效果的确定

5.3.2试纸条的组装

5.4讨论

第6章 结论与展望

参考文献

在校期间发表的论文和参加的研究课题

致 谢