TG2在非小细胞肺癌辐射敏感性中的调控作用和机制研究

摘要

在全球范围内，肺癌是最常见也是最致命的恶性肿瘤。根据中国国家计生委的数据显示，中国的肺癌发病率目前正以每年26.9％的速度增长，在过去的50年中，每10到15年肺癌患者的人数就增加一倍。中国第三次居民死亡原因调查结果显示，过去三十年间肺癌死亡率上升了465％，从而取代肝癌成为了中国致死率最高的恶性肿瘤。肺癌的病因至今尚不完全明确，但是严重影响了患者的生命健康和生存质量。因治疗方式有所不同，肺癌可分为两大类:小细胞型肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中非小细胞型肺癌更为常见，目前约占肺癌患者的87％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率极低，完全失去了手术根治的机会。因此，以放疗为主的综合治疗模式在NSCLC的治疗过程中就占据了重要地位。数据显示:约60％的患者在治疗不同阶段会应用该种治疗方法，但多数患者会出现不同程度的辐射抵抗，治疗效果不尽如人意。由此可见，如何增加NSCLC的辐射敏感性、克服其辐射耐受则是增强放射治疗效果最直接、最切中要害的研究思路，是肺癌放疗领域亟待解决的科学问题。　　越来越多的研究表明，组织型谷氨酰胺转移酶2（Transglutaminase2，TG2）在肺癌的发生发展中发挥着十分重要的作用，可能成为肺癌放疗增敏的新靶点。TG2是谷氨酰胺转移酶家族成员中研究较为广泛和深入的多功能蛋白，其主要功能是通过氨基酸共价交联机制，催化Ca2+依赖的翻译后蛋白修饰，同时，TG2又具有GTP/GDP结合活性、蛋白二硫键异构酶活性和蛋白激酶等活性功能，从而参与多种生理病理过程，如组织纤维化、细胞凋亡、细胞自噬、EMT等。研究表明Ca2+是TG2发挥转氨基作用的重要激活剂，高Ca2+浓度下TG2转氨酶活性被激活，其他活性被抑制;而在低Ca2+浓度下TG2即会发挥其他功能活性，这与TG2空间构象的改变密切相关。TG2大部分分布于细胞质内(70％)，约20％分布于细胞膜，仅有少量分布于细胞核（约5～7％）。目前发现，TG2在某些肿瘤的发生发展及转移恶化等过程中起到重要作用，癌细胞中TG2表达程度的不同与疾病的进程联系紧密。众多研究已经表明，TG2在肺癌、卵巢癌及乳腺癌等大部分肿瘤组织中均有较高表达，且高表达TG2的肺癌患者较低表达TG2肺癌患者的生存率低。最近也有研究显示，TG2可能参与DNA损伤修复的调控而在化疗药物的抵抗中发挥重要作用。但是TG2在肿瘤放射治疗方面的研究少之又少，更没有研究表明其在电离辐射造成DNA损伤修复中的作用。众所周知电离辐射造成细胞死亡的主要原因就是其对细胞DNA的损伤，故DNA损伤修复通路是研究辐射增敏及辐射防护的重要方向，因此TG2在肿瘤放疗中起到的作用及其在DNA损伤修复通路中的作用成为了本课题研究的重中之重。　　在本研究中，首先通过体内外模型发现抑制TG2具有显著的放射增敏效果。在体外实验中，利用Westernblot法对不同NSCLC细胞(A549，H1299，H460)、路易斯肺癌细胞(LLC)及人正常支气管上皮细胞BEAS-2B进行TG2蛋白含量检测，明确肺癌细胞TG2蛋白含量显著高于正常支气管上皮细胞。然后采用AnnexinⅤ细胞凋亡流式分析方法发现抑制TG2后进行照射，A549细胞凋亡率明显增加，而人正常支气管上皮细胞BEAS-2B无明显影响。进一步对不同NSCLC细胞(A549，H1299，H460)通过TG2siRNA或葡萄糖胺抑制TG2后进行克隆形成率实验，结果显示不同NSCLC细胞系不同抑制方式下，抑制TG2后细胞辐射敏感性均明显增高。在体内实验中，利用TG2抑制剂葡萄糖胺检测原位荷瘤小鼠的辐射敏感性，发现使用葡萄糖胺组的原位荷瘤小鼠照射后生存期明显延长，肿瘤显著缩小，辐射敏感性大幅提升，对肿瘤切片进行TUNEL及Ki67染色后发现，给药照射组肿瘤细胞较单纯照射组细胞凋亡率明显增加;其次，使用临床患者的肺癌样本及肺癌患者数据库，进一步明确了TG2表达与NSCLC患者预后之间的关系，证实TG2高表达严重影响肺腺癌患者预后。通过上述体内外实验，明确了抑制TG2在非小细胞肺癌放疗增敏中的重要作用。　　为了明确抑制TG2在非小细胞肺癌发挥放疗增敏作用的分子机制，采用中性彗星电泳实验进行分析，结果发现抑制TG2后NSCLC细胞照后DNA损伤明显加重。而通过Westernblot及免疫荧光实验发现，抑制TG2后照射引起的γ-H2AX磷酸化水平时间明显延长，非同源重组末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)两条DNA损伤修复通路的蛋白磷酸化(DNA-PKcs、ATM、ATR、Rad51)大幅降低，由此表明TG2在DNA损伤修复通路存在着重要作用。更为有趣的是，通过Westernblot及免疫荧光实验发现，电离辐射会导致细胞质内TG2大量进入细胞核，30min达到最大，8h后核内TG2会逐渐出核。进一步采用激光照射的实验方法对细胞核进行点状打击后发现，TG2募集到了DNA损伤修复位点，这就说明了TG2很有可能直接参与到了DNA损伤的修复过程，更加明确了TG2在DNA损伤修复通路中发挥着重要作用。更进一步，通过对照后细胞核内DNA结合蛋白和非DNA结合蛋白分离后发现，TG2在照后10min就已经开始结合在DNA上，而在照后2h TG2逐渐脱离DNA，4h TG2在细胞核内非DNA处达到最多。　　上述实验已经证明了抑制TG2在非小细胞肺癌中发挥放疗增敏作用是通过DNA损伤修复通路。为了进一步寻找TG2介导DNA损伤修复及辐射耐受的直接作用蛋白，使用免疫共沉淀和蛋白质谱技术，鉴定出134个照后与TG2相互作用的蛋白，并做了初步验证，结合文献调研和实验验证，最终锁定TOPOⅡα作为TG2的下游效应分子，进一步通过免疫共沉淀验证，结果显示照射后TG2明确与TOPOⅡα结合，且在TOPOⅡα敲低细胞中，发现照后DNA损伤加重且修复缓慢，而葡萄糖胺对TOPOⅡα敲低细胞的DNA损伤无明显的影响。Rescue实验显示，TOPOⅡα过表达显著激活了TG2敲除细胞中的DNA损伤修复通路，但TG2过表达并不影响TOPOⅡα敲除细胞的DNA损伤修复通路的活化。为了寻找TG2与TOPOⅡα作用的确切功能域，构建了TG2核心功能域缺失及核心功能点突变的细胞系，并进行了免疫共沉淀实验，发现任一功能域缺失都会影响其与TOPOⅡα的结合，而TG2W241突变可能会影响TG2与TOPOⅡα的相互作用，提示TG2转氨基活性可能在TG2-TOPOⅡα信号通路发挥关键作用。　　总之，本研究首次证实抑制TG2对非小细胞肺癌的放射增敏作用，明确了TG2可通过对NSCLC细胞中DNA损伤修复的调控产生直接相关作用，并发现TG2的直接作用蛋白为TOPOⅡα，其转氨基活性可能在TG2-TOPOⅡα信号通路发挥关键作用。这些研究结果为肺癌放疗增敏研究寻找到了新的分子靶点，为增加肺癌细胞放疗敏感性提供了新的方向和手段，在临床上改善放疗治疗效果方面具有重要意义。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

1、实验材料

2、实验方法

实验结果

1、NSCLC患者中肺腺癌内TG2高表达，且与预后密切相关

2、使用TG2抑制剂或敲低TG2显著增加NSCLC辐射敏感性

2．1不同细胞系及不同时间点照后TG2表达情况

2．2抑制TG2可显著增加NSCLC细胞辐射敏感性

2．3使用葡糖糖胺抑制TG2可增加原位荷瘤小鼠肺癌辐射敏感性

3、照后TG2入核并介导DNA损伤修复通路的激活

3．1电离辐射可诱导TG2进入细胞核

3．2抑制或敲低TG2可明显加重照后DNA损伤

3．3抑制或敲低TG2抑制DNA损伤修复通路的激活

4、TG2通过直接作用TOPOⅡα调控DNA损伤及辐射敏感性

4．2 TOPOⅡα为TG2在DNA损伤修复通路中的下游分子

4．3 TG2 W241A突变可能会影响TG2与TOPOⅡα的相互作用及NSCLC辐射敏感性

5、TG2及TOPOTOPOⅡα照后参与DNA损伤修复的运动过程分析

5．2 TG2及TOPOⅡα照后结合DNA的情况

5．3敲低TOPOⅡα，照后TG2入核加快

5．4 TG2照后入核因素探索

讨论

全文总结

参考文献

附录

文献综述 TG2核转位及其核内功能研究进展

在校期间论文发表情况

致谢