焦亡在内毒素所致小鼠急性肺损伤中的作用及其机制初步研究

摘要

研究背景：　　急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)是呼吸系统急症，感染、创伤、中毒是其常见病因。按原发病灶部位不同可将其分为肺内源性和肺外源性。急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)是急性肺损伤的严重阶段。ARDS是一种常见的危重症，在北美地区每年有超过15万的病例被诊断。其发病急骤、来势凶猛，以顽固性低氧血症为特征，表现为进行性加重的呼吸衰竭，并且传统的常规治疗手段难以纠正。需要更深入的研究发病机制和寻找新的治疗靶点。　　焦亡是一种新发现的炎症性的程序性细胞死亡，而在细胞焦亡的同时通常还伴随着炎症因子的高表达和机体炎症水平的上调。Gasdermin D(GSDMD)蛋白是经典细胞焦亡途径和非经典细胞焦亡途径的共同效应分子。GSDMD蛋白除了导致细胞焦亡，其还可以调控炎症因子的释放。虽然已有报道发现GSDMD的上游调控蛋白参与了脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）所致ALI/ARDS的发病过程，但目前尚无研究关注GSDMD蛋白是否参与并调控了ARDS的发生和发展。由此我们提出假设，在内毒素所致ARDS的发病机制中，GSDMD蛋白的表达与活化可能起到促进肺部病变加重的作用，如果对其进行抑制可能下调肺内炎症应激水平并且减轻肺组织的损害。　　研究方法：　　本研究拟从3部分来验证我们所提出的假设。第一部分，使用LPS通过经典和非经典途径验证小鼠肺泡巨噬细胞系(MH-S)是否可以被诱导出焦亡。对LPS焦亡诱导后的MH-S细胞，通过测定其乳酸脱氢酶(LDH)和IL-1β，荧光显微镜下观察细胞PI染色情况，细胞流式检测技术分析，RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测焦亡相关蛋白表达等指标，来判定MH-S细胞有无焦亡发生。第二部分，观察野生MH-S细胞株(WT)和GSDMD敲低MH-S细胞株(KD)对焦亡刺激后的反应。比较两者接受LPS干预后在细胞焦亡数量和炎症因子水平的差异，以此说明GSDMD蛋白在LPS导致MH-S细胞焦亡中的作用。第三部分，分别对野生型小鼠和GSDMD基因敲除小鼠经气管滴注LPS以造成急性肺损伤，然后通过肺组织病理检查、湿/干比、肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子和GSDMD蛋白检测评价小鼠肺损伤和炎症反应状况。从体内实验的角度进一步揭示GSDMD蛋白在LPS所致ALI/ARDS过程中的作用。　　研究结果：　　MH-S细胞在接受LPS+nigericin和LPS+CTB进行刺激后，培养基上清中LDH和IL-1β表达水平明显上调(p＜0.01)，PI染色以及流式检测阳性细胞百分比明显升高(p＜0.05)。说明LPS可以通过经典和非经典焦亡途径诱导MH-S细胞死亡。　　通过RT-qPCR和蛋白免疫印迹技术的检测，在接受焦亡刺激物处理后，MH-S细胞中分别出现caspase-1（经典途径）和caspase-11（非经典途径）mRNA表达上调(p＜0.05)和GSDMD蛋白的剪切活化增强(p＜0.01)。说明LPS可以介导MH-S细胞的焦亡。　　通过RNA干扰技术成功建立敲低GSDMD蛋白表达的MH-S细胞株。在接受LPS介导的焦亡刺激后，敲低细胞组细胞培养基上清中LDH、PI染色阳性细胞比例明显低于WT组(p＜0.05)，KD组上清中IL-β上升幅度较小(p＜0.01)。　　对C57BL/6小鼠使用经气管滴注LPS的方法进行急性肺损伤造模。经检测结果发现，ARDS造模成功后，相比于野生型小鼠(WT-ARDS组)，GSDMD基因敲除小鼠（KO-ARDS组）肺组织损伤病理评分、肺组织湿/干比、BALF中总蛋白水平明显较低(p＜0.01)，肺泡灌洗液中TF-α、IL-1β、IL-6水平明显较低(p＜0.05)。　　研究结论：　　1、LPS可以介导肺泡巨噬细胞系(MH-S)的焦亡，而且这种焦亡通过经典途径和非经典途径刺激均可实现。　　2、在LPS导致的MH-S细胞焦亡过程，伴随着细胞因子IL-1β的释放。　　3、下调MH-S细胞GSDMD蛋白表达可以起到抑制LPS导致的MH-S细胞焦亡和IL-1β分泌释放的作用。　　4、经气管滴注LPS可以诱导小鼠肺内出现GSDMD蛋白表达和活化并导致焦亡。　　5、在LPS所致ALI/ARDS的小鼠模型中，GSDMD基因敲除可有助于降低肺组织中的炎症水平并减轻肺组织损伤程度。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

参考文献

第一部分 建立LPS介导的肺泡巨噬细胞焦亡模型

一、引言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第二部分 GSDMD蛋白对LPS所致MH-S细胞焦亡的影响

一、引言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第三部分 GSDMD敲除对LPS所致小鼠急性肺损伤的保护作用

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

全文总结

感染性疾病中焦亡的相关研究进展

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况

致谢