肝脏富含的转录激活蛋白1(LAP1)对肝癌干细胞负向调控作用的研究

摘要

原发性肝癌是一种全球常见的、高发的恶性消化系统肿瘤，其中肝癌所致的死亡率在中国高居第二位。根据其组织学分型，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的类型，占总数的85％-90％。对于肝癌的治疗，近阶段首选的方法依然是手术切除。尽管近年来在肝癌的诊断以及外科治疗、生物治疗等综合治疗手段方面取得了很大的进步，但患者的5年生存率仍然没有得到较大的改善，由于易复发和肝内外转移，进行放疗或化疗效果也不甚理想，因此肝癌患者的预后不容乐观。究其原因，主要是因为肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞的存在，在肝癌复发和异质性维持中具有重要的作用。　　肿瘤干细胞理论的提出是基于肿瘤组织中并非所有的细胞都能够无限增殖，而只有存在于其中的数量极少的细胞才能持续地进行自我更新，并能形成处于各种分化阶段的具有异质性的肿瘤细胞。BonnetD等首次报道在急性髓细胞性白血病中有肿瘤干细胞的存在，到目前为止，人们已经分离并鉴定出包括黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胶质瘤、胰腺癌等至少30多种肿瘤的干细胞。根据文献报道，肝癌中也鉴定出了肝癌干细胞(liver cancer stem cells，LCSCs)，鉴定的表面标志物有CD133、CD13、CD90、EpCAM、OV6或CD24等。有文献证实，肝癌干细胞是肝癌转移、复发与耐药的根源。因此寻找新的、有效的靶向肝癌干细胞的治疗靶点，对于开发针对肝癌干细胞的药物或治疗策略，最终能有效地治疗肿瘤的转移、复发和耐药以降低高死亡率，具有非常重要的科学意义和临床应用潜力。　　转录因子C/EBPβ是CEBPs(CCAAT enhancer binding proteins)家族中已发现的6种成员之一，其C端具有高度保守的bZIP结构域:包含DNA结合结构域和二聚化功能域（亮氨酸拉链），bZIP结构域可以和靶基因的启动子、增强子区域的调节序列相互作用，从而对靶基因进行表达调控。　　C/EBPβ基因mRNA存在3个转录起始位点，因此可以选择性剪接形成3个异构体，翻译形成3种蛋白质，分别为LAP1(38kDa)和LAP2(35kDa)及LIP(20kDa)。其中LAP1和LAP2既有转录激活结构域，又有DNA结合结构域，LIP只有DNA结合结构域，两者在功能上具有拮抗作用。其中LAP1是在肝脏中表达最高的亚型。　　C/EBPβ是人与啮齿动物间进化高度保守的蛋白，在机体各组织中广泛表达。该基因参与细胞增殖、分化、凋亡及机体的免疫、应激反应、能量代谢、血液生成等生命活动。C/EBPβ还参与到了肿瘤的发生与进展，近些年研究表明，C/EBPβ的表达失调可以导致多种肿瘤发生恶化，如胶质瘤、Wilm's瘤、前列腺癌、肾细胞瘤、卵巢癌等。LAP1是具有广泛功能的重要的转录因子，它参与增殖、凋亡、侵袭、EMT等细胞分子事件进而影响肿瘤的发生与发展。本课题利用生物信息学的方法，并结合临床组织样本，发现LAP1在肝癌中表达显著降低，而LAP1在肝癌发生、发展中的作用及对肝癌干细胞(LCSCs)的影响却尚不清楚。本课题结合体外、体内实验系统研究了LAP1在肝癌及肝癌干细胞中的生物学作用，并针对LAP1相关信号转导的特点，选择小分子药物MDV3100开展了初步的临床转化研究。　　本课题首先通过生物信息学的方法及对肝癌组织临床样本的检测，比较LAP1在肝癌组织与癌旁组织或正常肝组织中的表达，发现LAP1在肝癌组织中表达低;进而运用流式细胞术及悬浮成球试验，比较LAP1在CD13+肝癌干细胞与非干细胞的表达情况，结果显示肿瘤干细胞中LAP1的表达显著低于非干细胞中表达，提示LAP1可能对肝癌恶性生物学行为起到负向调控作用。　　为了进一步探讨LAP1的细胞生物学功能，本课题进一步在肝癌细胞中过表达LAP1后，利用体外和体内实验模型，系统地分析了其对肝癌干细胞进而对肝癌群体细胞的各种生物学行为的影响。首先，包装慢病毒，用慢病毒介导的方法建立稳定过表达LAP1及GFP对照质粒的肝癌细胞系Huh7和CLC13，在体外进行悬浮成球实验分析过表达LAP1对成球率的影响，并利用流式细胞术和qPCR分析过表达LAP1对干性标志表达的影响，结果提示过表达LAP1可以抑制肝癌细胞的成球能力、下调肝癌干细胞的比例、以及肝癌干细胞标志物的表达水平;同时，开展了CCK8增殖实验、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验分析过表达LAP1对肝癌细胞的影响，并分析过表达LAP1对细胞周期、细胞凋亡的影响，结果提示LAP1过表达能显著抑制肝癌细胞的增殖能力、迁移能力与侵袭能力，并且诱发细胞周期阻滞;最后进行裸鼠成瘤实验，观察并分析过表达LAP1对肝癌细胞小鼠体内成瘤性和肿瘤生长的影响，结果提示LAP1过表达降低了肝癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力:皮下成瘤的数目、体积和重量均较对照组低，同时LAP1过表达降低瘤体干性标志物CD13、CD133及EpCAM的表达，同时显著降低增殖标志物Ki67的表达。　　细胞功能研究表明，LAP1表现出显著的肿瘤生物学功能的抑制作用，并参与肝癌干细胞的干性调控。诸多结果均提示LAP1可以作为肝癌治疗的有效靶标，基因治疗存在着很大的风险，临床应用还有很多挑战，因此筛选出可上调LAP1的小分子药物，具有更大的临床转化应用的潜力。有研究表明，雄激素受体对LAP1具有负向调控作用，而雄激素受体的表达与肝癌的预后具有相关性，这就提示通过抑制雄激素受体上调LAP1的表达在肝癌治疗中具有潜在应用价值。雄激素受体拮抗剂MDV3100是雄激素受体高度选择性拮抗剂，在前列腺癌的内分泌治疗中应用广泛。　　本课题进一步开展了雄激素受体拮抗剂MDV3100对肝癌治疗的初步研究，促进LAP1成为肝癌治疗靶标的转化应用。在肝癌细胞中，加入不同浓度的MDV3100，检测其对细胞活力的影响，结果显示MDV3100可降低肝癌细胞的活性;然后对不同MDV3100作用浓度处理后的肝癌细胞进行qPCR及WB检测，发现MDV3100可使LAP1的表达升高同时衰老标志物P53、P21、P16的表达也升高;结合经MDV3100处理后细胞形态上的体积增大及对衰老相关的β-半乳糖苷酶表达的比较而发现的SA-β-Gal染色阳性的明显增强，可初步判断出MDV3100可使肝癌细胞发生衰老;另外，对不同MDV3100作用浓度处理后的细胞进行细胞周期检测，发现MDV3100可抑制肝癌细胞的细胞周期。综上，MDV3100可通过上调LAP1诱导肝癌细胞发生衰老进而抑制肿瘤，因而LAP1可能可以作为肝癌治疗的新靶点，希望通过本课题的实施为肝癌的诊疗提供新的思路和可行方法。　　结论:　　本研究发现C/EBPβ在肝癌及肝癌干细胞中低表达;C/EBPβ的最主要且在肝脏中表达量最高的亚型LAP1能抑制肝癌干细胞的干性特征并能抑制肝癌的进展，其机制有待进一步研究;雄激素受体拮抗剂MDV3100可通过上调LAP1诱导肝癌细胞衰老，进而抑制肿瘤的发展。这些研究结果丰富了关于LAP1功能的认识，并提示LAP1具有作为肝癌治疗新靶点的可能性。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、LAP1在肝癌组织和癌旁组织及肝癌细胞系中的表达

二、LAP1在肝癌干细胞的表达

第二部分 LAP1在肝癌干细胞及肝癌细胞中的生物学功能研究

一、LAP1过表达对肝癌干细胞干性特征的影响

二、LAP1过表达对肝癌的一般生物学行为的影响

第三部分 雄激素受体拮抗剂MDV3100通过上调LAP1诱导肝癌细胞衰老的初步研究

一、药物MDV3100对肝癌细胞Huh7细胞活力的影响

二、雄激素受体拮抗剂MDV3100诱导肝癌细胞Huh7发生细胞衰老的初步研究

三、雄激素受体拮抗剂MDV3100对肝癌细胞Huh7细胞周期的影响

讨论

参考文献

综述

在读期间发表论文情况

致谢