氧化应激对性激素结合球蛋白表达影响及抗氧化酶基因多态性研究

摘要

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种育龄期女性常见的内分泌代谢紊乱性疾病，主要特征为稀发排卵或无排卵、临床或/和生化高雄(HA)及卵巢多囊样性改变。PCOS患者临床表现呈现高度的异质性，常伴有胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖脂代谢异常、氧化应激(OS)及亚临床慢性炎症等。目前关于PCOS的发病机制尚未被完全阐明。　　性激素结合球蛋白(SHBG)是一种由肝脏产生的同型二聚体血浆β球蛋白，能够结合和转运性激素，调节血液中游离性激素水平。SHBG与雄激素的亲和力最强，而与雌激素的亲和力稍弱，大多数由SHBG结合的雄激素不会发挥其生物学效应，只有少数未被SHBG结合的游离雄激素才能够发挥生物学效应。因此，SHBG在人体尤其是PCOS患者的雄激素水平调节中起着重要作用。　　OS是指机体中抗氧化防御功能与氧化活性分子生成之间的失衡，当机体发生OS时，随着氧化活性分子的增加或/和高密度脂蛋白(HDL)抗氧化功能的减弱，HDL与低密度脂蛋白(LDL)易受到氧化活性分子的攻击而形成氧化修饰HDL(ox-HDL)与氧化修饰LDL(ox-LDL)，导致PCOS患者体内存在着较高浓度的氧化修饰脂蛋白。氧化修饰脂蛋白能够激活包括核转录因子-κB(NF-κB)在内的多条细胞信号通路，上调多种炎症因子的表达，促进单核细胞和炎症细胞聚集，而各种炎症细胞又会产生大量的氧化活性分子，进一步加重机体OS。PCOS患者常伴有OS和低水平SHBG，但是目前关于OS是否会影响SHBG的表达与分泌尚未见相关报道。我们通过超速离心分离纯化得到HDL和LDL，以Cu2+作为氧化剂，制备得到ox-HDL和ox-LDL。使用脂蛋白和氧化修饰脂蛋白处理培养HepG2细胞后，采用化学发光法测定细胞培养上清SHBG浓度，采用荧光定量PCR和WesternBlotting方法对SHBG及相关调节因子(HNF-4α、COUP-TF1、PPAR-γ)的基因和蛋白表达水平进行分析。结果表明，与对照组相比，随着脂蛋白和氧化修饰脂蛋白处理时间的增长，SHBG及HNF-4α基因表达水平显著降低(P＜0.05)，并且氧化修饰脂蛋白处理组比脂蛋白处理组降低更加显著(P＜0.05)；未发现处理组与对照组间COUP-TF1和PPAR-γ基因表达水平存在统计学差异(P＞0.05)。此外，脂蛋白及氧化修饰脂蛋白处理细胞72h后，与对照组相比，细胞培养上清SHBG浓度以及HNF-4α蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)，并且氧化修饰脂蛋白处理组比脂蛋白处理组降低更加显著(P＜0.05)；未发现处理组与对照组间COUP-TF1和PPAR-γ蛋白表达水平存在统计学差异(P＞0.05)，蛋白水平分析趋势与mRNA结果一致，表明脂蛋白及氧化修饰脂蛋白可能通过下调HNF-4α表达而进一步降低SHBG的表达及分泌，并且氧化修饰脂蛋白的下调作用强于脂蛋白。　　此外，一些抗氧化酶基因多态性会导致抗氧化酶活性降低，使得机体氧化活性分子增加，继而发生OS。OS在PCOS的发生中扮演着重要角色，所以了解抗氧化酶基因多态性与PCOS发生的相关性对于PCOS发病机制的阐明具有重要意义。谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)和过氧化氢酶(CAT)是重要的细胞内抗氧化酶，与超氧化物歧化酶2(SOD2)共同维持机体OS的动态平衡。GPX1P198L和CATC-262T多态性均能够影响相应酶的活性，因此我们猜测GPX1P198L和CATC-262T多态性可能与PCOS的发生具有相关性。我们提取了PCOS患者及对照组血液样本DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法确定研究对象CATC-262T和GPX1P198L位点基因型，通过统计分析确定两个位点与PCOS发生的相关性。结果表明GPX1P198L多态性与PCOS的发生具有相关性(P＜0.05)，并且在PCOS组中L等位基因携带者(PL+LL)相比于PP基因型有着更低的痤疮评分(P=0.001)，同时腰围、平均卵巢体积和丙二醛水平均有增加的趋势(P＜0.07)。我们还结合本课题组前期工作，对GPX1P198L、CATC-262T和SOD2A16V三种多态性进行两两联合分析后发现，与PP/VV组合基因型相比，PCOS组中PL+LL/AV+AA组合基因型频率明显高于对照组(4.7% vs 1.1%)，以年龄和BMI为协变量的多项Logistic回归模型表明PL+LL/AV+AA组合基因型具有最高的PCOS发生风险(OR=5.774，95%CI：2.243-14.863，P＜0.001)。　　总之，我们发现脂蛋白及氧化修饰脂蛋白可能通过下调HNF-4α表达降低SHBG表达及分泌，并且氧化修饰脂蛋白下调作用明显强于脂蛋白，说明当PCOS患者体内发生OS时，随着氧化修饰脂蛋白的积累，可能会导致SHBG水平降低，从而使得体内游离雄激素升高，促进PCOS患者高雄激素血症的发生。此外，通过对抗氧化酶基因多态性研究发现GPX1P198L多态性与PCOS的发生具有相关性，同时PCOS组中L等位基因携带者(PL+LL)相比于PP基因型腰围、平均卵巢体积和丙二醛水平均有增加的趋势，推测GPX1P198L多态性可能会导致卵巢功能异常和增加OS水平从而增加PCOS发生风险。我们的研究表明OS在PCOS的发生中起着重要作用，因此，本论文的研究对PCOS发病机制的阐明能够提供一定的理论依据。

目录

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常用缩略词一览表

第1 章绪论

1.1 多囊卵巢综合征

1.1.1 多囊卵巢综合征概述

1.1.2 多囊卵巢综合征与代谢紊乱

1.1.3 多囊卵巢综合征与高雄激素血症

1.1.4 多囊卵巢综合征相关的易感基因

1.2 氧化应激

1.2.1 氧化应激概述

1.2.2 氧化应激与多囊卵巢综合征

1.2.3 氧化应激与高雄激素血症

1.3 性激素结合球蛋白

1.3.1 性激素结合球蛋白概述

1.3.2 性激素结合球蛋白与多囊卵巢综合征

1.3.3 性激素结合球蛋白与高雄激素血症

1.4 课题设计思路及意义

第2 章 脂蛋白分离纯化及氧化修饰

2.1 实验材料

2.1.1 实验试剂及材料

2.1.2 实验仪器

2.1.3 脂蛋白分离血液来源

2.2 实验方法

2.2.1 脂蛋白分离

2.2.2 脂蛋白纯化

2.2.3 脂蛋白浓度测定

2.2.4 脂蛋白氧化修饰

2.2.5 脂蛋白与氧化修饰脂蛋白氧化水平测定

2.2.6 统计学分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 脂蛋白分离纯化

2.3.2 脂蛋白与氧化修饰脂蛋白氧化水平测定

2.4 本章小结

第3 章脂蛋白与氧化修饰脂蛋白对SHBG 表达影响

3.1 实验材料

3.1.1 实验试剂及材料

3.1.2 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 细胞培养及脂蛋白处理

3.2.2 SHBG分泌浓度测定

3.2.3 SHBG及相关调节因子mRNA表达分析

3.2.4 SHBG相关调节因子蛋白表达分析

3.2.5 统计学分析

3.3.1 脂蛋白及氧化修饰脂蛋白对SHBG分泌浓度影响

3.3.2 脂蛋白及氧化修饰脂蛋白对SHBG及相关调节因子mRNA表达影响

3.3.3 脂蛋白及氧化修饰脂蛋白对SHBG相关调节因子蛋白表达影响

3.4 本章小结

第4 章抗氧化酶基因多态性与PCOS关系研究

4.1 实验材料

4.1.1 实验试剂及材料

4.1.2 实验仪器

4.1.3 实验样本来源

4.2 实验方法

4.2.1 临床资料及标本收集

4.2.2 血液DNA提取

4.2.3 激素、代谢和氧化应激水平测定

4.2.4 GPX1 P198L和CAT C-262T位点基因型鉴定

4.2.5 统计学分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 对照组与PCOS组临床特征、激素、代谢与氧化应激水平

4.3.2 GPX1 P198L和CAT C-262T位点基因型频率及等位基因频率

4.3.3 对照组和PCOS组中组合基因频率

4.3.4 GPX1 P198L位点不同基因型亚组之间各项指标差异

4.3.5 CAT C-262T位点不同基因型亚组之间各项指标差异

4.4 本章小结

结 论

致 谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文及学术成果