在一个巴基斯坦近亲结婚的家系中FANCM纯合移码突变导致男性不育的研究

摘要

精子发生包括原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)形成、迁移、增殖和分化，性原细胞增殖、静息和迁移，精原（干）细胞自我更新和分化，精母细胞减数分裂和精细胞变态形成精子一系列连续过程。其中任何一步发生异常，都会导致精子畸形、运动能力下降或数目减少（如临床上常见的畸、弱、少精子症），乃至无法形成（即临床上常见的无精子症），从而引发男性不育。男性不育影响约7％的男性。遗传因素可能是生精障碍的主要原因，但在大多数病例中，其发病病因仍不清楚。
　　本论文对一个巴基斯坦近亲结婚后代发生男性不育的家系进行研究，以期揭示其不育的原因。父母为表兄妹结婚，生育四个儿子，其中三个不育，两位为少弱精子症患者，另一位是无精子症患者。通过全外显子组和Sanger测序，筛选到范可尼贫血(Fanconi Anemia,FA)核心复合物成分FANCM的一个移码突变(c.1946_1958del，p.P648Lfs*16)与不育症共分离，认为是该家系不育患者的潜在致病突变。因为FANCM参与DNA链间交联（interstrand crosslink，ICL）损伤修复，所以我们检测患者外周血淋巴细胞对MMC诱发染色体断裂的敏感性。结果表明，相比于其父亲，患者的淋巴细胞呈现染色体断裂增加，且断裂频率随MMC浓度的增高而增多，提示该FANCM突变破坏其功能，并导致ICL损伤修复缺陷。
　　HEK293T细胞实验证实:该FANCM移码突变可导致截短蛋白形成，使FANCM不能定位于ICL位点，进而引起FANCD2不能被单泛素化、FA通路不能激活，最终导致ICL无法修复和细胞死亡。
　　我们制备了携带与患者几乎一致的Fancm突变(Fancm△C/△C)小鼠，发现纯合突变小鼠与患者表型类似，即:精子发生障碍、生育力大幅降低。具体表现为精子数目显著减少、运动能力降低，各级生精细胞大量丢失和圆形精细胞停滞。进一步发现:精原细胞对MMC敏感性增强、增殖受损和圆形精细胞DNA损伤修复缺陷，但减数分裂前期进程未受影响。有趣的是，所有患者和Fancm△C/△C成年小鼠均无明显的出生缺陷、骨髓造血功能衰竭、肿瘤或癌症等FA的典型症状。
　　综上，本论文第一次发现FANCM纯合突变导致生精障碍，引起男性不育，但不引起骨髓造血功能衰竭;提供了FANCM纯合突变导致非典型FA（我们定义为FA-M）的直接证据，为雄性不育及FA的诊断和遗传咨询提供指导。

目录

声明

摘要

1．1 引言

1．2 精子发生

1．2．1 生殖细胞命运决定

1．2．2 原始生殖细胞迁移和存活

1．2．3 性原细胞增殖、静息和迁移

1．2．4 精原细胞自我更新和分化

1．2．5 精母细胞减数分裂

1．2．6 精子形成

1．3 范可尼贫血与DNA链间交联修复

1．3．1 范可尼贫血

1．3．2 DNA链间交联产生原因和结果

1．3．3 FA通路与链间交联修复

1．3．4 FA通路的其他作用

1．3．5 FA通路与其他修复机制的交互作用

1．4 FANCM的功能

1．4．1 FANCM在FA通路的功能

1．4．2 FANCM的独特作用

1．4．5 FANCM在复制叉重塑中的作用

2．1．1 小鼠信息

2．1．2 细胞系及菌种

2．1．3 质粒载体

2．1．4 引物序列

2．1．5 抗体信息

2．1．6 耗材及试剂

2．1．7 实验仪器

2．1．8 溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 病例收集

2．2．2 全外显子组测序

2．2．3 外周血淋巴细胞培养及染色体断裂分析

2．2．4 质粒构建

2．2．5 细胞培养及转染

2．2．6 构建FANCM-／-稳定的293T细胞系

2．2．7 外源导入FANCM回补内源FANCM敲除实验

2．2．8 免疫荧光

2．2．9 Western Blot

2．2．10 RNA抽提

2．2．11 RT-PCR

2．2．12 基因敲除小鼠制备

2．2．13 小鼠生育力检测

2．2．14 睾丸组织包埋及切片

2．2．15 组织切片苏木精伊红染色(HE)

2．2．16 组织切片免疫荧光染色

2．2．17 小鼠精母细胞铺展及染色

2．2．18 BrdU染色

2．2．20 精子计数

2．2．21 精原细胞中期染色体断裂分析

2．2．22 统计学分析

3．1 实验结果

3．1．1 巴基斯坦近亲结婚家系中男性不育的临床表型

3．1．2 巴基斯坦家系不育患者中筛选并确定FANCM纯合移码突变

3．1．3 FANCM突变导致患者染色体断裂修复缺陷但不导致骨髓衰竭

3．1．4 FANCM突变功能缺失损害FA通路

3．1．5 FANCM突变降低细胞存活率

3．1．6 FancmΔC／ΔC小鼠无骨髓衰竭

3．1．7 FancmΔC／ΔC雄性小鼠生育力降低

3．1．8 FancmΔC／ΔC雄性小鼠精子发生异常

3．1．9 FancmΔC／ΔC雄性小鼠出生前后生殖细胞增殖减少

3．1．10 FANCM突变与精子变形阶段DNA断裂修复

3．2 讨论

参考文献

攻读博士期间的主要学习成果

致谢

附录