高通量筛选及基因组重排选育维吉尼亚霉素高产菌

摘要

维吉尼亚霉素(virginiamycin)是由Streptomyces virginiae（维吉尼亚链霉菌）发酵合成的一种动物专用饲料添加剂，该抗生素结构新颖，是由两类化学结构完全不同的因子构成，抗菌谱窄，不易使微生物产生抗药性，主要对革兰氏阳性菌，如八叠球菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等有抗性，是业内公认的具有良好应用前景的安全无毒畜禽专用抗生素。目前，维吉尼亚霉素已经在国外实现商业化生产，中国尚未开展工业生产。因此，作为疗效优异的抗生素，对S.virginiae进行深入的研究和开发具有重要的意义。
　　本文围绕如何提高维吉尼亚霉素产量，对S.virginiae进行诱变育种后，应用基因组重排技术选育维吉尼亚霉素高产菌株，主要研究内容和结果如下:
　　建立了测定S.virginiae发酵液中维吉尼亚霉素含量的高效液相色谱法。该方法准确性好，可作为维吉尼亚霉素的定量研究方法。
　　以微孔板为载体，结合以藤黄微球菌为敏感菌的生物活性检测法，建立了适合维吉尼亚霉素产生菌快速筛选的高通量培养与检测体系，该高通量筛选方法具有操作简单、处理量大、节约原材料、快速高效、平行性高等优点，可以应用于维吉尼亚霉素高产突变株的快速筛选，效果较好，同时，也为其他抗生素高产突变株的快速筛选提供思路。
　　以S.virginiae CICC11013为出发菌株，经离子束、微波、紫外等诱变处理，并选用硫酸链霉素作为抗性筛选剂，最终选育出四株突变株，MW158、MW1243、UV1150及UV1154，产量分为58.2mg/L、50.7mg/L、61.2mg/L及53.3mg/L。
　　对S.virginiae的原生质体制备、再生及融合进行了研究，利用三因素三水平的正交实验，考察溶菌酶浓度、酶解时间及二级菌丝培养时间对原生质体制备率与再生率的影响，最终确定最佳的原生质体制备与再生条件为二级菌丝培养30h后，利用浓度为3mg/mL的溶菌酶进行酶解，时间为60min。利用紫外及加热灭活法进行原生质体融合，紫外灭活最佳条件为30W紫外灯距离10cm处照射20min，热灭活最佳条件为温度65℃，加热20min。原生质体融合时采用40％的PEG1000，于30℃下融合5min，此时融合率达到98％。
　　以诱变UV1150、UV1154、MW158及MW1243作为基因组重排的亲本，利用基因组重排育种技术，结合硫酸链霉素抗性的标记及高通量筛选方法来提高维吉尼亚霉素高产突变株的筛选，最后经过五轮基因组重排，得到了一株遗传稳定的重组菌株G5-103，其摇瓶发酵产量约为251mg/L，比亲本中最高的UV1150产量提高了3.1倍。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 维吉尼亚霉素概述

1．1．1 发现与命名

1．1．2 结构特点

1．1．3 理化性质

1．1．5 VGM的作用

1．1．6 VGM的市场现状

1．1．7 VGM的检测

1．2 菌种选育策略

1．2．1 物理诱变

1．2．2 化学诱变

1．2．3 复合诱变

1．2．4 筛选

1．2．5 原生质体融合

1．2．6 基因组重排育种

1．2．7 维吉尼亚链霉菌菌种选育

1．2．8 发酵原料

1．2．9 维吉尼亚链霉菌发酵调控

1．3 本课题研究的意义和主要内容

1．3．1 本课题研究的意义

1．3．2 本课题研究的技术路线及主要内容

第二章 VGM检测方法的研究

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 培养基

2．1．5 培养条件

2．2 实验研究方法

2．2．1 检测波长的选择

2．2．2 色谱图

2．2．3 提取溶剂的选择

2．2．4 流动相的选择

2．3．1 检测波长的选择

2．3．2 色谱图

2．3．3 提取溶剂的选择

2．3．4 流动相的选择

2．3．5 方法线性范围

2．4 本章小结

第三章 VGM高产菌株的高通量筛选方法的建立

3．1 引言

3．2 实验方法

3．2．1 菌种

3．2．2 试剂和仪器

3．2．3 微孔板培养器

3．2．4 培养基

3．2．5 培养条件

3．2．6 分析条件

3．3 结果与分析

3．3．1 24微孔板高通量最佳培养体系的确定

3．3．2 深孔板微量培养替代摇瓶培养用于评估VGM产量

3．3．3 深孔板微量培养与摇瓶培养的比较

3．3．4 生物活性检测法可HPLC方法比较用于快速检测VGM

3．3．5 高通量筛选方法进行高产菌的筛选

3．4 本章小结

4．1 前言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 菌种

4．2．2 试剂和仪器

4．2．3 培养基

4．2．4 培养条件

4．3 实验方法

4．3．1 维吉尼亚链霉菌种的保藏方法

4．3．2 发酵液中维吉尼亚链霉菌生物量测定方法

4．3．3 发酵液中VGM测定方法

4．3．4 诱变育种方法

4．3．5 筛选方法

4．4 结果与分析

4．4．1 菌种传代培养

4．4．2 硫酸链霉素最小抑制浓度的确定

4．4．3 自然选育筛选VGM高产突变株

4．4．4 超声波诱变育种筛选VGM高产突变株

4．4．5 氮离子束诱变育种筛选VGM高产突变株

4．4．6 微波诱变育种筛选VGM高产突变株

4．4．7 紫外诱变育种筛选VGM高产突变株

4．4．8 传代稳定性试验

4．5 本章小结

4．5．1 出发菌株筛选

4．5．2 超声诱变筛选VGM高产菌株

4．5．3 离子束诱变筛选VGM高产菌株

4．5．4 微波诱变筛选VGM高产菌株

4．5．5 紫外诱变筛选VGM高产菌株

第五章 VGM产生菌的原生质体融合

5．2 材料与方法

5．2．1 菌种

5．2．2 试剂和仪器

5．2．3 培养基

5．2．4 培养条件

5．3 结果与分析

5．3．1 维吉尼亚链霉菌的种子液生长曲线

5．3．2 再生培养基确定

5．3．3 甘氨酸浓度对原生质体形成的影响

5．3．4 原生质体制备与再生最佳条件确定

5．3．5 双灭活对原生质体的影响

5．3．6 PEG浓度对融合率的影响

5．3．7 融合温度对融合率的影响

5．3．8 双灭活的原生质体融合及再生

5．4 本章小结

6．1 前言

6．2 材料与方法

6．2．1 菌种

6．2．2 试剂和仪器

6．2．3 培养基

6．2．4 培养条件

6．2．5 分析条件

6．3 结果与分析

6．3．1 基因组重排亲本的选择

6．3．2 五轮基因组重排提高硫酸链霉素耐受性

6．3．3 五轮基因组重排提高VGM产量

6．3．4 重排菌株G5-103遗传稳定性测定

6．3．5 G5-103与原始菌株菌落形态的比较

6．3．6 重排菌株G5-103摇瓶发酵过程曲线

6．4 本章小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果