Sorafenib纳米药物的抗肿瘤免疫效应及FoxO1调节肿瘤相关巨噬细胞的机制研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述: 第一部分 Sorafenib纳米药物的抗肿瘤免疫效应 Sorafenib（索拉菲尼）是一种口服的多激酶、多靶向抑制剂，该抑制剂能够抑制Ras/Raf的活性，并影响细胞的增殖和血管生成，从而可以起到抑制肿瘤生长的作用。Sorafenib于2006年被FDA批准用于治疗晚期肾细胞癌，并于2007年被批准用于晚期肝癌的治疗。虽然可以明显延长患者的存活时间，但是由于其严重的副作用和耐药问题，Sorafenib只能延长患者3-5个月的存活时间。因此，探究其副作用产生的机制以及如何克服耐药问题是Sorafenib临床应用的一个难题。研究中，利用小鼠的荷瘤模型探究Sorafenib对免疫系统和造血系统产生的副作用，进一步制备了PEG-PLGA包裹Sorafenib的纳米药物，并详细阐明了Sorafenib纳米药物在抗肿瘤免疫中的作用。取得的实验结果如下: (1)Sorafenib抑制肿瘤进程呈现出剂量依赖的效果 构建了B16-F10的小鼠荷瘤模型，通过灌胃给药的方式，发现Sorafenib抑制肿瘤生长需要较高的浓度。进一步在体外的实验发现了，随着Sorafenib浓度的升高，TGF-β和CD47这些免疫负调分子也是逐渐上升的，提示Sorafenib对机体的免疫系统具有较大的副作用。 (2)口服Sorafenib可以破坏荷瘤小鼠的免疫系统和造血系统 重点分析了Sorafenib对荷瘤小鼠免疫系统和造血系统的影响。通过分离荷瘤小鼠骨髓以及免疫器官中的细胞，发现Sorafenib可以导致小鼠骨髓中Lin-Sca-1+c-kit+的造血前体细胞明显减少。并且小鼠的脾脏重量、脾脏中的免疫细胞、肝脏中的免疫细胞都出现了明显的异常，这是高剂量的的Sorafenib带来的造血系统和免疫系统的损伤。 (3)PEG-PLGA包裹Sorafenib的纳米药物的制备和表征 为了降低高剂量的Sorafenib带来的免疫系统和造血系统损伤，制备了PEG-PLGA包裹包裹的Sorafenib纳米材料，并对该纳米药物的一些特性进行了相应的表征，包括粒径大小、稳定性、药物释放情况等。 (4)低剂量的Sorafenib纳米药物可以高效抑制肿瘤生长且副作用比较小 分析Sorafenib纳米药物的抗肿瘤效果，发现低剂量的Sorafenib纳米药物就可以高效抑制肿瘤的生长（效果约等同于9倍剂量的灌胃），但是之前看到的Sorafenib对免疫系统和造血系统的损伤得到了明显的改善。 (5)免疫细胞在Sorafenib纳米药物的抗肿瘤效果中起了重要的作用 Sorafenib纳米药物高效抑制肿瘤生长的现象在结直肠癌细胞系(MC38)和肺癌细胞系(LLC)中也得到了验证。但是发现在免疫系统缺陷的小鼠(Rag-/-)中，Sorafenib纳米药物抑制肿瘤生长的现象并不是很明显。这一实验结果表明，适应性免疫细胞在Sorafenib纳米药物的抗肿瘤过程中起到了重要作用。 (6)Sorafenib纳米药物可以改善小鼠肿瘤的免疫微环境 最后，检测了Sorafenib纳米药物处理后，荷瘤小鼠肿瘤微环境中免疫细胞的变化。发现，Sorafenib纳米药物可以导致促肿瘤生长的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）明显减少，而抑制肿瘤生长的T细胞和NK细胞的比例明显升高，从而起到了改善肿瘤免疫微环境的效果。 第二部分 Fox01调节肿瘤相关巨噬细胞的机制研究 巨噬细胞根据其解剖位置和功能的差异，可以分为不同的亚群，包括肝脏中的枯否细胞，脑部的小胶质细胞，骨髓中的破骨细胞，肺脏中的肺泡巨噬细胞等，这些免疫细胞在机体的稳态和器官特异性疾病中发挥了重要的作用。在肿瘤微环境中，巨噬细胞一方面可以通过其表面的一些抑制性分子来抑制T细胞的活性和功能；另一方面又可以通过分泌CCL5等来招募调节性T细胞，从而在肿瘤微环境中起到很强的免疫负调作用。另外，从肿瘤原位逃逸的肿瘤细胞，通过分泌CCL2可以招募CCR2阳性的单核细胞，这部分单核细胞进一步分化为巨噬细胞从而协助肿瘤细胞的转移。但是巨噬细胞的表型并不是一成不变的，在一些放化疗药物的处理或者细胞因子的刺激下，具有免疫负调作用的巨噬细胞可以转变成为具有免疫正调作用的巨噬细胞，从而可以活化T细胞，促进T细胞的抗肿瘤免疫反应。转录因子Fox01是Fox0家族中的重要成员，其发挥作用主要是在细胞核中，当其被磷酸化后会出核，进而被泛素化降解，从而导致其转录活性的下调。在此，我们系统地探究了转录因子Fox01调节肿瘤相关巨噬细胞的机制，取得的实验结果如下： (1)肿瘤相关巨噬细胞中Fox01的水平是明显下调的 首先，我们通过免疫荧光的手段检测了肿瘤相关巨噬细胞中Fox01的定位，我们的结果表明Fox01主要位于细胞浆中，是磷酸化没有活性的形式。进一步我们利用MHc-n将巨噬细胞分为MHC-Ⅱhigh和MHC-Ⅱlow的两群细胞，实验结果表明MHC-Ⅱlow的巨噬细胞Fox01水平要明显低于MHC-Ⅱhigh的巨噬细胞。 (2)巨噬细胞缺陷Fox01后会倾向于M2型极化 巨噬细胞具有很强的可塑性，接下来我们构建了巨噬细胞特异性敲除Fox01的小鼠，并进行了表达谱分析。GSEA分析显示缺陷Fox01的巨噬细胞更倾向于M2型巨噬细胞极化的状态，表明转录因子Fox01对巨噬细胞的极化具有重要的调节作用。 (3)Fox01调控巨噬细胞的抗原提呈功能 通过分析表达谱的数据，我们发现H2-Aa，Ciita等一系列跟抗原提呈相关的基因在缺陷了Fox01的巨噬细胞中是明显下调的，并且证明了Fox01对Ciita的重要调控作用。 (4)低氧微环境导致巨噬细胞中Fox01水平下调 接下来我们在体内和体外探究导致肿瘤相关巨噬细胞中Fox01水平下调的原因，结果发现肿瘤细胞的分泌物并不能影响Fox01的水平，而是肿瘤的低氧微环境诱导了巨噬细胞中Fox01水平的下调。 (5)巨噬细胞中Fox01的过表达可以抑制肿瘤的生长 最后我们验证了将巨噬细胞中Fox01作为治疗靶点的可能性。巨噬细胞缺陷Fox01的小鼠中，肿瘤表现出更快的生长速度。将过表达Fox01的巨噬细胞和肿瘤细胞混在一起进行荷瘤实验，结果表明巨噬细胞过表达Fox01之后，可以明显抑制肿瘤细胞的生长，从而在小鼠体内验证了巨噬细胞中Fox01的重要调控作用。

目录

声明

摘要

符号说明

图序

表序

第一章绪论

1．1免疫细胞在肿瘤微环境中的作用

1．2 Sorafenib在肿瘤治疗中的进展研究

1．3免疫治疗，纳米治疗等肿瘤治疗的新策略

2．1．1实验用小鼠信息

2．1．2实验肿瘤细胞系信息

2．1．3实验试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．2实验方法

2．2．2小鼠荷瘤模型的构建

2．2．3小鼠肿瘤细胞内免疫细胞的分离方法

2．2．4小鼠肝脏中免疫细胞的分离方法

2．2．5小鼠脾脏中免疫细胞的分离方法

2．2．6小鼠骨髓中单个核细胞的分离方法

2．2．7 Sorafenib纳米药物的制备过程

2．2．9 Sorafenib纳米药物在血清中的稳定性检测

2．2．10体外检测纳米药物释放Sorafenib的情况

2．2．11流式细胞术检测细胞表面分子

2．2．12实时荧光定量PCR

2．2．13 CBA检测血清中细胞因子的步骤

2．2．14统计学分析方法

第三章实验结果和讨论

3．1 Sorafenib抑制肿瘤生长具有剂量依赖性

3．2 Sorafenib导致免疫细胞和造血系统异常

3．3 Sorafenib纳米药物的制备和表征

3．4 NPsorafenib可以高效抑制肿瘤生长并且具有较小的副作用

3．5 NPsorafenib的治疗效果在免疫缺小鼠中不佳

3．6 NPsorafenib可以影响荷瘤小鼠的肿瘤免疫微环境

3．7小结与讨论

第四章绪论

4．1巨噬细胞的转录调控研究

4．2转录因子FoxO1的研究

4．3肿瘤低氧微环境

5．1实验材料

5．1．1实验用小鼠信息和细胞系信息

5．1．2实验试剂

5．1．3主要实验仪器

5．2实验方法

5．2．1小鼠基因型鉴定

5．2．2小鼠骨髓来源巨噬细胞的诱导

5．2．3免疫荧光染色

5．2．4 Western Blot检测FoxO1的水平

5．2．5 si-RNA-FoxO1的转染

5．2．7基因芯片检测巨噬细胞中mRNA表达水平

5．2．8统计学分析方法

第六章实验结果和讨论

6．2巨噬细胞缺陷FoxO1后倾向M2型极化

6．3 FoxO1调控巨噬细胞中MHC-Ⅱ的表达

6．4低氧微环境诱导了巨噬细胞中FoxO1水平的下调

6．5巨噬细胞中FoxO1调节肿瘤的生长

6．6小结与讨论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与其他研究成果

附录