耐万古霉素屎肠球菌溯源性研究及临床应用

摘要

屎肠球菌（Enterococcus faecium，Efm）是医院感染的重要病原菌之一，可引起人体多部位感染，包括泌尿系统感染、血流系统感染、心内膜炎、腹膜炎、盆腔感染、皮肤和皮肤结构感染及少见的中枢系统感染。由于屎肠球菌对头孢菌素、克林霉素、复方新诺明天然耐药，对氨基糖苷类抗菌药物天然低水平耐药，对糖肽类抗菌药物可产生获得性耐药，所以治疗多重耐药的屎肠球菌感染可选择的抗菌药物极其有限，临床治疗非常棘手。目前耐万古霉素屎肠球菌(Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium，VREfm)有逐年增加的趋势，形势不容乐观。本研究通过对耐万古霉素屎肠球菌的耐药表型、耐药基因型、耐药转座子结构、多位点序列分型和全基因组序列进行分析，研究其遗传背景和相关耐药机制，对该菌的预防控制具有重要意义。　　目的：调查2015年1月到2017年7月西南医科大学附属医院和成都某院临床标本所分离的43株VREfm的耐药特征，为临床合理使用抗菌药物提供依据;分析43株VREfm耐药基因、耐药转座子结构和多位点序列分型，研究其遗传背景;分析SY1、LY19、LY22三株耐万古霉素屎肠球菌全基因组基本特征，研究其相关耐药机制。　　方法：(1)收集2015年1月到2017年7月西南医科大学附属医院和成都某院临床标本所分离的43株VREfm，用美国布鲁克MALDI-TOF MS质谱仪重新鉴定菌种，用法国生物梅里埃VITEK2-Compact全自动微生物分析仪检测13种抗菌药物耐药情况，并用微量肉汤稀释法检测万古霉素和替考拉宁的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)值，确定其耐药表型。(2)采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)方法和sanger测序技术检测所有菌株中的VanA、VanB和VanD万古霉素耐药基因;用引物重叠PCR(overlapping PCR)方法对耐药转座子结构分析;采用多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）分析所有菌株的序列型(Sequence type，ST)。(3)通过第二代高通量测序技术对SY1、LY19、LY22三株VREfm进行全基因测序，原始测序结果进行拼接、组装、基因预测、基因功能注释，耐药基因和同源基因进行溯源性比较分析。　　结果：(1)43株VREfm对青霉素、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、红霉素、克林霉素耐药率均达到100％，对利奈唑胺、替加环素、奎奴普丁/达福普汀、高浓度链霉素、四环素、高浓度庆大霉素和呋喃妥因的敏感率分别为100％、100％、97.7％、88.4％、83.7％、44.2％和4.7％。对万古霉素（Vancomycin，VAN）和替考拉宁(Teicoplanin，TEC)MIC值均较高（VAN≥64μg/ml，TEC≥32μg/ml）。(2)耐药基因检测结果显示43株VREfm均属VanA基因型。转座子Tn1546结构分为五个类型，其中B型所占比例最高79.1％(34/43)，其余类型C型占9.3％(4/43)，D型占7.0％(3/43)，A型占2.3％(1/43)，E型占2.3％(1/43)，且在B型和C型有IS1216V反插入序列。MLST得到了7个ST型：ST17、ST78、ST203、ST363、ST555、ST1392、ST1394，其中ST17占74.4％(32/43)，ST78占14.0％(6/43)，其余5个型别各1株。7个型都属于克隆复合群17(Clonal Complex17，CC17)，ST1392、ST1394为新发现的ST型。(3)测序结果显示，VREfm SY1基因组基因序列全长2435331bp，GC含量38.5％，共有2909个编码基因，其中24个耐药相关编码基因，独有基因家族数257个;LY19基因组基因序列全长2567058bp，GC含量38.3％，共有3135个编码基因，其中27个耐药相关编码基因，独有基因家族数330个;LY22基因组基因序列全长2516184bp，GC含量38.4％，共有3078个编码基因，其中29个耐药相关编码基因，独有基因家族数323个。LY19含有tetO核糖体保护蛋白基因，aad(6)氨基糖苷类腺苷转移酶基因和AAC(6′)-Ie-APH(2″)-Ia氨基糖苷类双功能酶基因，LY22含有tetK外排汞基因，AAC(6′)-Ie-APH(2″)-Ia氨基糖苷类双功能酶基因。　　结论：(1)43株VREfm均是多重耐药菌，且属于VanA表型。利奈唑胺、替加环素、奎奴普丁/达福普汀是治疗VREfm的首选。(2)43株VREfm均是VanA基因型，部分转座子有IS1216V反插入序列。所有菌株经MLST分为7个型，属于CC17克隆复合群。ST17和ST78是主要的ST型。(3)tetO、tetK是引起四环素耐药的基因，AAC(6′)-Ie-APH(2″)-Ia和aad(6)是分别引起高浓度庆大霉素和高浓度链霉素耐药的基因。

目录

摘要

前言

1．1 材料与方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 实验方法

1．2 结果

1．2．1 菌落生长特征及鉴定结果

1．2．3 43株屎肠球菌药敏试验结果

1．3 讨论

第二部分 耐万古霉素屎肠球菌耐药基因、转座子结构及多位点序列分型研究

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果

2．2．2 转座子Tn1546基因内部片段扩增及比对结果

2．2．3 耐万古霉素屎肠球菌的等位基因谱和序列型

2．2．4 eBURST分析结果

2．3 讨论

第三部分 耐万古霉素屎肠球菌的基因组学分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果

3．2．1 三株屎肠球菌基因组提取结果

3．2．2 三株屎肠球菌鉴定结果

3．2．3 三株屎肠球菌扫描图测序结果

3．3 讨论

结论

研究不足与展望

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

万古霉素耐药肠球菌研究进展 综述

声明