草鱼鱼肉抗氧化肽的制备、分离鉴定及其活性研究

摘要

本论文以草鱼鱼肉为原料，通过单因素实验确定了制备高抗氧化活性酶解产物的最佳可控酶解工艺，然后使用交联葡聚糖凝胶G-25（Sephadex G-25）对酶解产物进一步纯化并利用Nano-LC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS对目标组分中肽段的序列进行鉴定，筛选出符合抗氧化肽特征的肽段进行合成并对其抗氧化活性进行验证，同时研究了抗氧化肽间的协同作用，以期为其在保健食品中的应用提供一些理论依据。　　（1）以水解度和抗氧化能力为评价指标，通过单因素实验优化了复合蛋白酶-碱性蛋白酶二步酶解制备草鱼鱼肉酶解物（GCHs）的条件，并对酶解产物的体外抗氧化活性（ABTS·+清除能力，O2·-清除能力和Fe2+螯合能力）和氨基酸组成进行了分析。结果表明，固定复合蛋白酶酶解条件，碱性蛋白酶二步酶解的最优条件为：料液比，4%；pH，9.0；酶添加量，6000U/g；酶解温度，50℃；酶解时间，2h。在此条件下制得的酶解产物富含疏水性氨基酸和酸性氨基酸，且其ABTS·+和O2·-清除能力以及Fe2+螯合能力的IC50值分别为0.21、5.60、2.47mg/mL。　　（2）通过测定GCHs的分子量分布，并采用活性跟踪手段结合Sephadex G-25色谱柱对GCHs进行纯化，然后通过Nano-LC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS技术对目标肽段的氨基酸序列进行鉴定。结果表明，GCHs主要由小分子多肽组成，分子量分布在5400Da以下，经Sephadex-G25纯化后共得到五个组分，其中组分3（F3）具有最强的ABTS·+清除能力和O2·-清除能力，其IC50值分别为0.11和0.47mg/mL，比纯化前分别提高了1.91和11.91倍。从F3中鉴定出26条平均局部置信度得分（ALC）≥95%的寡肽的结构，并通过抗氧化肽的结构特征筛选出15条抗氧化肽。　　（3）通过测定合成的15条抗氧化肽的ABTS·+清除能力、O2·-清除能力以及DPPH·清除能力验证其抗氧化活性，并分析其协同作用。结果表明，结构为WEPPR、VAGW、LLPDDGDH的寡肽分别具有最强的DPPH·、ABTS·+和O2·-清除能力，其GSH当量值分别为324.83、139.77、529.06μmol GSH/mg。肽段氨基酸组成中的Trp、Tyr、Pro、Arg等对ABTS·+和DPPH·的清除贡献较大，而O2·-的清除则可能与Asp有较大关系。合成的寡肽间既存在协同作用也存在拮抗作用。

目录

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第一章 绪论

1.1 课题来源

1.2 草鱼简介

1.3 抗氧化肽的制备

1.4 抗氧化肽的分离纯化及鉴定

1.5 抗氧化肽的构效关系

1.6 抗氧化肽的活性评价方法

1.7 课题研究内容

1.8 研究意义

1.9 创新性

第2章 酶解草鱼鱼肉制备抗氧化活性肽工艺优化

2.1 引言

2.2 实验材料及仪器设备

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第3章 草鱼鱼肉抗氧化肽的分离纯化与鉴定

3.1 引言

3.2 实验材料及仪器设备

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第4章 抗氧化肽活性验证及协同作用分析

4.1 引言

4.2 实验材料及仪器设备

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

在读期间公开发表论文（著）及科研情况