琥珀酸产生菌的分离鉴定、诱变选育及发酵条件优化

摘要

细菌发酵生产琥珀酸成本低廉、对环境污染少。由于其生产原料可再生，并能吸收利用温室气体CO<,2>，使之成为近年来国内外生物质能源转化的研究热点。‘本研究通过采用选择性较强的富集培养和快速准确筛选程序，从牛瘤胃中分离出适于淀粉质原料的琥珀酸产生菌，并进行相关的生理生化鉴定：通过紫外照射诱变育种得到琥珀酸高产突变株，优化培养基组成并确定最适发酵培养条件。主要研究结论如下： 1．在富集培养中添加莫能菌素和富马酸钠，经溴甲酚绿变色平板快速检出500株产酸菌株。菌株发酵后经TLC初筛和改进后的HPCE方法复筛检测，得到6株优良产酸菌株，其中B-15菌株产琥珀酸11.5 g·L<'-1>，副产物甲酸4.65 g·L<'-1>，乙酸6.25 g·L<'-1>，该菌株琥珀酸产量最高。菌株B-15经生理生化鉴定后，初步确定其为放线杆菌属(Actinobacillus sp．)。 2．以B-15为出发菌株，通过紫外照射诱变，依次采用溴甲酚绿平板、氟乙酸平板和丙烯醇平板对菌株进行定向选育，得到的突变株FB-4发酵产琥珀酸19.90 g·L<'-1>，副产物乙醇7.55 g·L<'-1>，甲酸2.05 g·L<'-1>，乙酸4.85 g·L<'-1>，其琥珀酸产量较原始菌株提高70％。 3．对突变株FB-4进行发酵试验的结果表明，最佳发酵培养基组成为，葡萄糖50 g·L<'-1>，酵母提取物10 g·L<'-1>，玉米浆5 g·L<'-1>，K<,2>HPO<,4> 3g·L<'-1>，MgCl<,2>·6H<,2>O 0.4 g·L<'-1>，CaCl<,2> 0.3 g·L<'-1>，NaCl 0.5 g·L<'-1>，MgCO<,3> 15 g·L<'-1>，复合氮源对菌株发酵影响较大；摇瓶最适发酵培养条件为，温度37℃，接种量5％，转速100 r·min<'-1>，厌氧发酵气室控制条件为，40％CO<,2>，5％H<,2>。在上述条件下初始pH 7.0，发酵48h，琥珀酸产量达24 g·L<'-1>。

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致谢

第一章 引言

1.1琥珀酸的结构及理化性质

1.1.1琥珀酸的物理性质

1.1.2琥珀酸的化学性质

1.2琥珀酸的生产与应用

1.2.1化学合成法

1.2.2发酵法

1.2.3琥珀酸生产方法成本核算

1.2.4琥珀酸的应用

1.3国内外发酵琥珀酸菌种的研究现状

1.3.1产琥珀酸放线杆菌

1.3.2曼海姆产琥珀酸菌

1.3.3产琥珀酸厌氧螺菌

1.3.4基因工程大肠杆菌

1.4课题研究的目的、意义及内容

1.4.1研究的目的和意义

1.4.2主要研究内容

第二章 琥珀酸产生菌的分离筛选与初步鉴定

2.1实验材料

2.1.1菌种来源

2.1.2试剂材料与仪器

2.1.3培养基

2.2菌株初步鉴定方法

2.2.1形态特征鉴定方法

2.2.2生化反应鉴定方法

2.3分离筛选方案设计

2.3.1筛选步骤

2.3.2采样

2.3.3富集培养

2.3.4纯种分离

2.3.5发酵培养与预处理

2.3.6 TLC薄层色谱点样初筛

2.3.7 HPCE法确定复筛产物检测方法

2.3.8发酵液中有机酸检测方法的建立

2.4结果与分析

2.4.1富集培养与纯种分离结果

2.4.2薄层色谱法初筛

2.4.3复筛检测方法HPCE的优化及筛选结果

2.4.4形态特征的鉴定结果

2.4.5生化反应的鉴定结果

2.5本章小结

第三章 产琥珀酸菌株的诱变选育

3.1材料与方法

3.1.1材料与仪器设备

3.1.2主要培养基的制备

3.1.3试验方法

3.1.4检测方法

3.2诱变试验方案

3.2.1诱变前处理

3.2.2紫外线照射诱变试验

3.2.3平板筛选

3.2.4突变株与B-15发酵产酸比较试验

3.2.5方案流程图

3.3结果与讨论

3.3.1原始菌株的生长曲线

3.3.2最适紫外线照射诱变剂量

3.3.3平板筛选试验结果

3.3.4突变株与原始菌株B-15发酵产酸性能比较

3.4本章小结

第四章 突变菌株发酵条件优化

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2主要仪器与设备

4.1.3培养基和培养条件

4.1.4检测方法

4.2实验方案

4.2.1不同碳源对发酵的影响

4.2.2碳源浓度对发酵的影响

4.2.3不同氮源对发酵的影响

4.2.4氮源配比对发酵的影响

4.2.5 Mg2+、Ca2+、K+、Na+四种无机盐离子对发酵的影响

4.2.6温度对发酵的影响

4.2.7 CO2浓度对发酵的影响

4.2.8转速对发酵的影响

4.2.9接种量对发酵的影响

4.3结果与讨论

4.3.1培养基组成对突变株产琥珀酸的影响结果

4.3.2培养条件对突变株发酵产琥珀酸的影响结果

4.4本章小结

第五章 结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献