JNK/MAPK信号通路在氯化镉致小鼠原代星形胶质细胞死亡机制的初步研究

摘要

目的：　　(1)利用体外原代培养的细胞，研究镉对星形胶质细胞的毒性作用；　　(2)探讨JNK/MAPK信号通路是否参与了镉诱导的星形胶质细胞死亡过程。　　方法:　　(1)小鼠大脑皮质星形胶质细胞原代培养：取新生24h内（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠大脑皮质，体外培养至9～14天，采用胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）免疫细胞化学法鉴定星形胶质细胞；　　(2)以0、5、10、20、40μmol/L镉染毒0、3、6、9、12、24h，倒置相差显微镜观察细胞形态变化；采用c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）特异性抑制剂SP600125（终浓度50μ mol/L）预处理细胞45min，给予镉染毒0、3、6、9、12、24h，倒置相差显微镜观察细胞形态变化；　　(3)以0、5、10、20、40μmol/L镉染毒9、12h，MTT法测定氯化镉对星形胶质细胞的毒性作用；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率；　　(4)以0、5、10、20、40μmol/L镉染毒9、12h，Western blot检测JNK磷酸化水平；以0、10、20μmol/L镉染毒0、3、6、9、12h，Western blot检测星形胶质细胞JNK磷酸化水平；采用JNK特异性抑制剂SP600125(50μmol/L)预处理细胞45min，给予镉染毒9、12h，Western blot检测JNK磷酸化水平。　　结果：　　(1)体外原代培养的星形胶质细胞，呈多角形，锥形等，胞体大，胞突丰富；胞核圆形或卵圆形，偏于一侧。培养至9～14天，经GFAP免疫细胞化学染色，阳性细胞胞浆和突起呈棕黄色，阳性细胞数达95％，可用于后续实验。　　(2)倒置相差显微镜观察细胞形态变化：镉浓度为0～5μmol/L，星形胶质细胞形态未见明显改变；10μmol/L，随染毒时间延长，细胞突起变细变短，细胞间隙开始增大；20μmol/L，星形胶质细胞胞体回缩、突起消失或成毛刺状，细胞间隙进一步增大，细胞稀疏，部分细胞收缩成球形、坏死，脱落漂浮于培养基内；40μmol/L时，细胞收缩成球形，坏死，细胞脱壁漂浮于培养液中。SP600125预处理45min，倒置相差显微镜观察细胞形态变化：0～10μmol/L,细胞形态未见明显改变；20μmol/L，细胞形态与单独染镉组比较，仅部分细胞突起变细变短、胞体回缩；40μmol/L，细胞形态与单独染镉组比较，细胞间网络连接仍存在，细胞胞体收缩呈球形，但未脱壁；　　(3)MTT法检测结果显示，氯化镉对原代培养星形胶质细胞有一定细胞毒性作用：镉浓度为0μmol/L，染毒9、12h均未引起细胞存活率下降；镉浓度为5～40μmol/L，染毒9、12h细胞存活率均明显下降，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率：0、5、10、20、40μmol/L镉作用9h，细胞凋亡率分别为（7.40±0.50）%、（9.60±0.20）%、（11.50±1.00）%、（21.70±1.10）%、（3.80±0.40）%；作用12h，细胞凋亡率分别为（6.90±0.30）%、（11.50±1.50）%、（13.00±1.50）%、（16.80±1.00）%、（0.30±0.05）%；5～20μmol/L镉浓度时，细胞凋亡率随染毒剂量增加而增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；至40μmol/L，随着作用时间延长，坏死细胞数增加，分别为（53.40±0.25）%、（96.10±0.15）%；(4)Western blot检测结果：10～40μmol/L镉处理9、12h，JNK磷酸化水平增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；10、20μmol/L镉染毒0～12h，JNK磷酸化水平增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。SP600125预处理细胞，JNK磷酸化水平降低，与单独染镉组比较差异有统计学意义(P<0.01)。　　结论：　　(1)体外成功原代培养小鼠大脑皮质星形胶质细胞。　　(2)氯化镉对原代培养小鼠大脑皮质星形胶质细胞有明显的毒性作用，可抑制细胞生长；并诱导原代培养小鼠大脑皮质星形胶质细胞凋亡及坏死。　　(3)JNK/MAPK信号通路参与了镉诱导的星形胶质细胞死亡过程，JNK信号通路特异性抑制剂SP600125对镉诱导的星形胶质细胞死亡有一定的保护作用。

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第一部分 小鼠大脑皮质星形胶质细胞原代培养方法的建立及鉴定

1 材料

2 方法

3 结 果

4 讨 论

第二部分 镉对体外培养小鼠大脑皮质星形细胞的毒性作用

1 材料

2 方法

3 结 果

4 讨 论

第三部分 镉对小鼠大脑皮质星形胶质细胞内JNK/MAPK信号通路的影响

1材料

2方法

3 结 果

4 讨 论

结论

参考文献

综述:JNK信号通路研究进展

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