猪肌肉组织中一组糖酵解酶和碱性磷酸酶的纯化及其部分性质的探究

摘要

呈味核苷酸是肉品中形成风味特性的主要物质，其中肌苷酸作为衡量肉质鲜味的重要指标之一，而肌苷酸的生成和降解与一些酶密切相关。本论文首先对猪肌肉组织中肌苷酸含量变化做了相应的了解，并通过对其相关的一组糖酵解酶和碱性磷酸酶的纯化及其部分性质的研究，探讨了它们对于肌苷酸生成和降解作用的影响，旨在探索诱导核苷酸类呈味物质形成过程相关酶的作用机理。
　　 (1)猪肌肉组织中肌苷酸含量变化。采用高效液相色谱法测定在4℃温度条件下猪肌肉组织中肌苷酸(IMP)含量的变化，从而了解肌苷酸在猪宰后的变化情况，初步探讨了其与品质之间的关系。结果表明，随着猪宰后贮藏期的延长，IMP含量呈先上升，在第2天达到峰值，然后不断下降的规律;通过测定IMP含量变化不但可以作为预测猪肉新鲜度指标，而且可在猪肉贮藏与加工过程中反应其品质优劣。
　　 (2)猪肌肉组织中一组糖酵解酶的纯化及降解性质的探讨。对猪肌肉组织中一组糖酵解酶进行纯化，分别采用丙酮沉淀、离子交换层析、SDS-PAGE电泳、LC-MS等方法，并通过高效液相色谱法进一步研究其降解作用，从而探讨生鲜猪肉中糖酵解酶分别与品质，风味之间的关系。经证实这种纯化方案效果显著，得到一组糖酵解酶，经鉴定分别为1，3异构丙酮酸激酶、3，3异构丙酮酸激酶，后两种可能为磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶;这一组糖酵解酶通过单因素实验确定了最佳降解的浓度为100μg/mL，其可以有效降解ATP，对IMP未见任何降解作用，在此过程中ATP的减少量为9.2395μg，对ATP的降解产物含有ADP、IMP;3min后降解产物中含有2.1451μg的ADP，30min的降解产物IMP和ADP含量分别为1.0687μg和2.0093μg。这一组糖酵解酶是糖酵解过程中的关键酶，它们不仅与猪肉肉质密切相关，而且对风味物质的代谢过程具有一定的影响。
　　 (3)猪肌肉组织中碱性磷酸酶的纯化及其部分性质的研究。采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、SDS-PAGE电泳等方法，从猪肌肉组织中分离纯化碱性磷酸酶。提纯倍数为57.34，比活力为28.77U/mg蛋白质。经SDS-PAGE呈现单一条带，且亚基的分子量为66KD左右。该酶催化底物硝基苯磷酸二钠(p-NPP)的最适pH为9.7;最适温度为30℃。Mg2+和Ca2+对其有激活作用，Zn2+和EDTA对其有抑制作用。

目录

声明

摘要

致谢

第一章 绪论

1．1 核苷酸类呈味物质中的肌苷酸和鸟苷酸性质及其代谢途径

1．1．1 肌苷酸和鸟苷酸性质

1．1．2 肌苷酸的代谢途径

1．2 与核苷酸类呈味物质相关的酶系

1．2．1 ATP酶

1．2．2 5’-AMP脱氨酶(AMPD)

1．2．3 IMP降解酶

1．2．4 磷酸酶

1．2．5 5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)酰胺转移酶和PRPP合成酶

1．2．6 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)

1．3 动物体中糖酵解关键的几种酶

1．3．1 磷酸甘油酸激酶

1．3．2 丙酮酸激酶

1．3．3 磷酸果糖激酶

1．3．4 烯醇化酶

1．4 蛋白质的分离纯化

1．4．1 分离纯化蛋白质的一般程序步骤

1．4．2 蛋白质的分离纯化方法

1．5 研究目的与意义

第二章 猪肌肉组织中肌苷酸含量的变化

2．1 引言

2．2 实验材料和仪器设备

2．2．1 采样

2．2．2 试剂标准品

2．2．3 试剂与药品与仪器

2．2．4 仪器设备

2．3 实验设计

2．4 IMP测定的样品前处理

2．5 IMP测定的色谱条件

2．6 标准溶液配制

2．7 感官评定

2．8 结果与分析

2．8．1 标准品色谱图

2．8．2 标准曲线

2．8．3 IMP含量的变化

2．9 小结

第三章 猪肌肉组织中一组糖酵解酶的纯化及降解性质的探讨

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 采样

3．2．2 试剂、药品与仪器

3．3 实验方法

3．3．1 粗提

3．3．2 丙酮分级沉淀

3．3．3 离子交换层析

3．3．4 电泳

3．3．5 质谱1D-LC-MS

3．3．6 高效液相色谱(HPLC)

3．4 结果与分析

3．4．1 酶的纯化

3．4．2 糖酵解酶的分子质量

3．4．3 质谱1D-LC-MS的蛋白质鉴定结果

3．4．4 HPLC测定降解结果

3．5 讨论

3．5．1 猪肌肉组织中糖酵解关键酶对代谢产能及其品质的影响

3．5．2 猪肌肉组织中纯化出的一组糖酵解酶的降解作用

3．5．3 形成核苷酸类风味物质代谢途径相关的酶系

3．6 小结

第四章 猪肌肉组织中碱性磷酸酶的纯化及其部分性质的研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 采样

4．2．2 试剂、药品与仪器

4．3 实验方法

4．3．1 粗提

4．3．2 硫酸铵分级分离

4．3．3 离子交换层析

4．3．4 凝胶过滤

4．3．5 电泳(SDS-PAGE)

4．3．6 AKP酶比活力的测定

4．3．7 PH-活性曲线的制作和酸碱稳定性试验

4．3．8 温度-活性曲线的制作和热稳定性试验

4．3．9 几种金属离子及EDTA对AKP酶活的影响

4．4 结果与分析

4．4．1 AKP的纯化

4．4．2 电泳图

4．4．3 AKP酶比活力测定结果

4．4．4 PH-AKP活性曲线的制作和酸碱稳定性试验结果

4．4．5 温度-AKP活性曲线的制作和热稳定性试验的结果

4．4．6 几种金属离子及EDTA对AKP酶活的影响结果

4．5 小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 研究展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文