植物甾醇酯的酶促合成及其对高脂血症大鼠血脂代谢的影响

摘要

植物甾醇是一类存在于植物体内的天然生物活性成分，主要通过抑制膳食和胆汁中的胆固醇在肠道内的吸收从而达到降胆固醇的效果，由于游离的植物甾醇在水和油脂中的低溶解性，限制了其实际应用范围。研究发现酯化后的植物甾醇酯，可大大增加植物甾醇的溶解性，能比较方便地添加到油脂类食品中。目前，植物甾醇酯的合成主要有化学法和酶法，与化学法相比，酶法具有反应条件温和，高效专一，副反应较少，产物质量好并易于纯化分离等优势。本文选择酶法催化合成植物甾醇酯，改进植物甾醇酯的分离提纯方法，获得高纯度产品；以不同植物甾醇酯产品，进行等剂量高脂血症大鼠的血脂代谢影响研究，探索植物甾醇酯降低高脂血症的作用效果。主要研究结果如下：
　　(1)研究了脂肪酶催化植物甾醇和油酸反应合成植物甾醇油酸酯。运用中心组合设计，以酯化率为考察指标，对脂肪酶Candida rugosa催化合成植物甾醇油酸酯进行了优化研究。通过甾醇酯化率的响应面分析，研究了反应温度、反应时间、底物摩尔比(油酸：植物甾醇)和加酶量及其交互作用对酯化反应的影响，构建了相应的回归模型，并进行了验证，结果表明：反应温度41℃，反应时间19h，底物摩尔比2.4:1，加酶量7%为最佳条件，酯化率可达77.43%。
　　(2)采用薄层色谱法(TLC)、紫外光谱法(UV-VIS)、红外光谱法(FT-IR)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，对甾醇酯进行了有效的检测分析及结构表征。TLC、UV-VIS、FT-IR法可以判断反应产物中基本不含甾醇，形成酯键。GC-MC检测分析证明反应产物主要为β-谷甾醇酯、豆甾醇酯、菜油甾醇酯以及少量的菜籽甾醇酯；进而对产物进行分离提纯，经GC检测甾醇酯纯度达91.2%。
　　(3)以植物甾醇油酸酯和亚油酸酯对高脂血症大鼠的血脂代谢影响进行研究。在建立高脂血症大鼠模型基础上，分组给予高/低剂量的两种甾醇酯，干预6周后，测定结果表明，两种甾醇酯均具有降血脂作用，能显著降低大鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和载脂蛋白ApoB，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和载脂蛋白ApoAⅠ水平；添加有甾醇亚油酸酯实验组的降血清胆固醇效果明显优于甾醇油酸酯组，且两种甾醇酯均能有效清除自由基和减少脂质过氧化物丙二醛(MDA)，对于减缓高脂血症有显著作用。

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第一章 绪 论

1.1 植物甾醇及甾醇酯

1.1.1 结构及性质

1.1.2 生理功能

1.1.3 应用

1.2 植物甾醇酯合成方法

1.2.1 化学合成法

1.2.2 酶促催化合成法

1.3.3 超临界酶催化合成法

1.3 植物甾醇酯检测方法

1.3.1 薄层色谱法

1.3.2 红外光谱法

1.3.3 高效液相色谱法

1.3.4 气相色谱法

1.3.5 超临界流体色谱法

1.4 本课题研究意义及内容

1.4.1 课题研究意义

1.4.2 课题主要研究内容

第二章 酶法合成植物甾醇酯的结构鉴定

2.1 材料与仪器

2.1.1 实验材料与试剂

2.1.2 仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 原料的预处理

2.2.2 植物甾醇与油酸的酯化反应原理

2.2.3 酶法催化合成的植物甾醇油酸酯

2.2.4 薄层色谱检测(TLC)

2.2.5 紫外光谱检测(UV-VIS)

2.2.6 红外光谱检测(FT-IR)

2.2.7 气相色谱-质谱检测(GC-MS)

2.3 结果与讨论

2.3.1 薄层色谱分析(TLC)

2.3.2 紫外光谱分析(UV-VIS)

2.3.3 红外光谱分析(FT-IR)

2.3.4 气相色谱-质谱分析(GC-MS)

2.4 本章小结

第三章 响应面优化植物甾醇酯的酶促合成

3.1 材料与仪器

3.1.1 实验材料与试剂

3.1.2 仪器与设备

3.2 实验方法

3.2.1 酶法合成植物甾醇油酸酯的响应面试验

3.2.2 植物甾醇酯化率的测定

3.2.3 植物甾醇酯的分离纯化

3.3 结果与讨论

3.3.1 响应面试验方案与结果

3.3.2 回归模型的有效性分析

3.3.3 二次回归模型的显著性检验

3.3.4 验证实验

3.3.5 植物甾醇酯的分离提纯

3.4 小结

第四章 高脂血症动物模型的建立

4.1 实验动物和饲养环境

4.2 材料与仪器

4.2.1 主要材料

4.2.2 主要仪器

4.3 实验方法

4.3.1 动物分组及处理

4.3.2 检测方法

4.3.3 统计学处理

4.3.4 结果分析判断依据

4.4 结果与讨论

4.4.1 体重和进食量的变化

4.4.2 大鼠高脂血症动物模型血脂水平变化

4.5 小结

第五章 两种植物甾醇酯的降血脂及抗氧化功能的比较研究

5.1 材料与仪器

5.1.1 主要材料与试剂

5.1.2 主要仪器

5.2 动物分组及处理

5.3 实验方法

5.3.1 动物的一般情况

5.3.2 血脂水平和血液生化指标测定

5.3.3 统计学处理

5.4 结果与讨论

5.4.1 体重和进食量的变化

5.4.2 植物甾醇酯对大鼠血清TC和TG水平的影响

5.4.3 植物甾醇酯对大鼠HDL-C和LDL-C水平的影响

5.4.4 植物甾醇酯对大鼠肝脏组织的影响

5.4.5 植物甾醇酯对大鼠载脂蛋白的影响

5.4.6 植物甾醇酯对大鼠肝脏组织SOD活性和MDA含量的影响

5.5 小结

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

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