阪崎克罗诺杆菌的检测及耐酸机制研究

摘要

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种可以在人及动物肠道内寄生生存的革兰阴性菌，该菌可以引发新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症等严重疾病，且感染后死亡率高达40％-80％，引起全球的广泛关注。研究发现，感染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉，而克罗诺杆菌的传统分离方法存在一定的缺陷，高效的生物学及分子生物学技术的发展则对克罗诺杆菌菌种的检测和分型以及预防和治疗阪崎克罗诺杆菌的感染具有重要意义。食源性致病菌的耐酸特性也是其发挥其致病性的关键前提条件之一。目前，国内对其酸胁迫应答机制研究还鲜有报道。
　　本文首先通过添加万古霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷、头孢菌素和蔗糖等物质建立了一种优于DFI(Druggan-Forsythe-Iversen)和改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST)的克罗诺杆菌分离方法，该方法、DFI和mLST方法对克罗诺杆菌的灵敏度分别为100％、87.5％和87.5％;而特异性分别为88.8％、77.7％和87.5％。然后，基于TaqⅠ单酶切gluB基因片段进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析，建立一种能鉴定克罗诺杆菌的同时还可以快速、准确地区分都柏林克罗诺杆菌（Cronobacter dublinensis），丙二酸盐阳性克罗诺杆菌（Cronobactermalonaticus），穆汀斯克罗诺菌（Cronobacter muytjensii）和阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）的种间特异性分子分型靶标技术。最后，本文探索性通过菌体接合方法成功建立了阪崎克罗诺杆菌的基因敲除方法，获得外膜蛋白OmpW突变株△OmpW和谷氧还蛋白GrxB突变株△GrxB，并通过耐酸性、形态特征和生物膜相关指标变化初步探讨OmpW、 GrxB在阪崎克罗诺杆菌中耐酸变化中的作用，发现这两个基因与该菌的耐酸性有关，为进一步开展OmpW、GrxB在该菌致病中的作用机制提供参考数据。
　　本研究的开展将为防控阪崎克罗诺杆菌生物污染及保障食品安全奠定基础。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 立题背景及意义

1．2 克罗诺杆菌的分类

1．3 克罗诺杆菌的生物学特性

1．3．1 形态

1．3．2 菌落特征

1．3．4 营养要求

1．3．5 培养条件

1．3．6 阪崎克罗诺杆菌的耐酸性

1．3．5 生化反应

1．4 克罗诺杆菌在食品及环境中的污染分布

1．5 克罗诺杆菌的检测方法

1．5．1 经典方法

1．5．2 DFI(Druggan-Forsythe-Iversen)法

1．5．3 荧光选择性鉴别培养基法

1．5．4 IDF方法

1．5．5 阳离子磁性珠快速捕获法

1．6 分子生物学方法

1．6．1．聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)

1．6．2．荧光PCR(Fluorescence PCR)

1．7 基因敲除技术

1．7．1 基因敲除的基本原理

1．7．2 基因敲除的应用

1．7．3 基因敲除的常用技术

1．7．4 基因敲除技术优缺点

1．8 细菌生物膜

1．9 本论文的目的意义与研究内容

1．9．1 选题研究背景、意义

1．9．2 本课题研究的主要内容

1．9．3 项目资助

第二章 用于奶粉中克罗诺杆菌分离的改良培养方法

2．1 材料

2．1．1 菌株来源

2．1．2 培养基

2．1．3 仪器与设备

2．1．4 生化试剂与样品

2．2 实验方法

2．2．1 克罗诺杆菌的复苏培养

2．2．2 商业婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的分离

2．2．3 API-20E生化鉴定

2．2．4 阪崎克罗诺杆菌的16S rDNA鉴定

2．3 结果与讨论

2．3．1 人工模拟污染奶粉中菌体培养

2．2．2 商业婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的分离

2．4 本章小结

第三章 建立一种区分克罗诺杆菌种的分子分型技术

3．1 材料

3．1．1 菌株来源

3．1．2 实验试剂和仪器

3．2 方法

3．2．1 菌株活化

3．2．2 DNA提取

3．2．3 gluA、gluB基因扩增

3．2．4 PCR-RFLP

3．3 结果与讨论

3．3．1 gluA、gluB基因扩增

3．3．2 PCR-RFLP

3．5 小结

第四章 阪崎克罗诺杆菌基因敲除的方法建立

4．1 材料

4．1．1 菌株和质粒来源

4．1．2 实验试剂和仪器

4．2 方法

4．2．1 菌株活化

4．2．2 DNA提取

4．2．3 扩增同源臂

4．2．4 构建重组载体

4．2．5 同源重组

4．3 结果与讨论

4．3．1 扩增同源臂

4．3．2 构建重组载体

4．3．3 同源重组

4．4 本章小结

第五章 OmpW、GrxB基因的耐酸机制初步探索

5．1 材料

5．1．1 菌株来源

5．1．2 实验试剂和仪器

5．2 方法

5．2．1 基因敲除

5．2．2 菌株活化

5．2．3 野生株、△OmpW和△GrxB突变菌株前后表型变化

5．3 结果与讨论

5．3．1 菌落形态变化

5．3．2 细胞形态变化

5．3．3 耐酸性实验

5．3．4 生物膜(Biofilm，BF)变化

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 主要结论

6．2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况