紫薯花青素的提取、纯化及其抗氧化和益生元活性研究

摘要

紫薯花青素是一种水溶性的天然色素，因其具有安全无毒、营养丰富、色泽鲜艳、稳定性强等特点，被广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。本文主要对紫薯花青素进行提取、纯化，通过工艺优化提高其得率和纯度;进一步通过制备型液相色谱分离得到紫薯花青素单体，并用LC-MS/MS对其结构进行鉴定;研究制得的五种紫薯花青素单体的抗氧化活性，对肠道益生菌的增殖作用和对有害菌的抑制作用。主要研究结果如下:
　　1、用酶法对紫薯花青素进行提取。以紫薯花青素的得率为评价指标，通过单因素试验和响应面分析得到紫薯花青素的最佳提取工艺参数为:柠檬酸浓度3.5％，纤维素酶添加量79 U/mL，料液比1∶15，温度55℃，时间2h，在此条件下，紫薯花青素的得率为137.28±1.30μg/g。
　　2、采用DM301、D101、HP-20、X-5和AB-8五种大孔树脂对紫薯花青素的粗提液进行静态吸附和解吸试验。结果表明，X-5大孔树脂具有较好的纯化效果;当紫薯花青素粗提液中花青素的浓度为1.08 mg/mL时，X-5的最大吸附量为14.00mL/mL（湿树脂）;优化得到的最佳的纯化工艺参数为:上样流速和洗脱速度均为2 mL/min，上样液pH3.0，洗脱液（乙醇）浓度80％。纯化后得到的紫薯花青素的纯度为36.82±1.03％。
　　3、分析型液相色谱表明，紫薯花青素中共有12种组分;用制备型液相色谱对这12种组分进行制备，并经分析型液相色谱检测，为单一色谱峰，峰面积均达到95％以上（峰4除外）。用LC-MS/MS对12种组分进行结构鉴定，结合质谱图以及文献推测得到这12个组分分别为:矢车菊素-3-槐糖苷-5-葡糖苷、芍药素-3-槐糖苷-5-葡糖苷、矢车菊素-3-对-羟基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷、芍药素-3-对-羟基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷、矢车菊素-3-阿魏酰槐糖苷-5-葡糖苷、芍药素-3-阿魏酰槐糖苷-5-葡糖苷、矢车菊素-3-咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷、矢车菊素-3-咖啡酰-对-羟基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷、矢车菊素-3-咖啡酰-可魏酰槐糖苷-5-葡糖苷、芍药素-3-咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷、芍药素-3-咖啡酰-对-羟基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷、芍药素-3-咖啡酰-阿魏酰槐糖苷-5-葡糖苷。
　　4、考察了紫薯花青素粗提物(PSPAs)和五种主要花青素单体，P1（芍药素-3-槐糖苷-5-葡糖苷）、P2（芍药素-3-阿魏酰槐糖苷-5-葡糖苷）、P3（芍药素-3-咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷）、P4（芍药素-3-咖啡酰-对-羟基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷）和P5（芍药素-3-咖啡酰-可魏酰槐糖苷-5-葡糖苷）的体外抗氧化活性，结果表明:它们对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基都具有一定的清除能力，且具有一定的还原力和对Fe2+的螯合力。但它们的抗氧化能力存在一定的差异，且均弱于阳性对照（Vc或EDTA）。这可能是因为紫薯花青素具有酚羟基，可以提供H原子，与自由基相结合。
　　5、采用体外厌氧培养的方式，研究了PSPAs、P1、P2、P3、P4和P5对两歧双歧杆菌(B.bifidum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)的活性影响。结果显示:PSPAs、P1、P2、P3、P4和P5对四种益生菌均有一定的增殖作用，并且在试验范围内，其对益生菌的增殖作用随着浓度的增加呈现先快速增强及后缓慢减弱的趋势，但相比于FOS，紫薯花青素对四种益生菌的增殖作用稍弱;由于化学结构、分子量大小、分支程度，所连接糖苷的数量和种类的不同，五种紫薯花青素单体对四种益生菌的促生长作用也不尽相同，P1对四种肠道益生菌的增殖作用均最强，当P1的浓度为1.5 mg/mL时，青春双歧杆菌的浓度达到最大(1.69 g/L)，P2和P3的益生元效果次于P1，而P4和P5对肠道益生菌的增殖作用相对较弱。添加PSPAs、P1、P2、P3、P4和P5后，在益生菌的培养过程中，其培养基的pH均出现了明显的降低，这说明益生菌能够有效地利用紫薯花青素，并且产生有机酸。因此，紫薯花青素对肠道益生菌具有增殖作用，是一种潜在的益生元。
　　6、采用滤纸片法研究了PSPAs、P1、P2、P3、P4和P5对有害菌的抑制作用，结果显示:PSPAs以及P1、P2、P3、P4和P5五个组分对金黄色葡萄球菌（S.aureus）和沙门氏菌（salmonella）均有一定的抑制作用，且均对沙门氏菌的抑制作用最强，金黄色葡萄球菌次之，不同样品对同种致病菌的抑制作用大小为:P4＞P5＞P3＞P2＞PSPAs＞P1。P4和P5对两种致病菌的最小抑菌浓度均最小，均为0.25mg/mL。

目录

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致谢

摘要

缩写词对照表

第一章 前言

1．1 紫薯研究概述

1．1．1 紫薯简介

1．1．2 紫薯利用现状和发展趋势

1．2 花青素及紫薯花青素

1．2．1 花青素的结构及分类

1．2．2 花青素的理化性质

1．2．3 紫薯花青素简介

1．3 花青素的提取方法

1．3．1 溶剂提取法

1．3．2 超声波辅助提取法

1．3．3 微波辅助提取法

1．3．4 酶解法

1．3．5 其它提取方法

1．4 花青素的纯化方法

1．4．1 大孔树脂法

1．4．2 膜分离法

1．4．3 制备型高效液相色谱法(PHPLC)

1．5 花青素的结构鉴定方法

1．5．1 光谱分析法

1．5．2 高效液相色谱法

1．5．3 液质联用法

1．5．4 核磁共振法

1．6 花青素的生物活性研究

1．6．1 抗氧化活性

1．6．2 抗突变和抗肿瘤活性

1．6．3 对益生菌的增殖作用和对有害菌的抑制作用

1．6．4 保护肝脏作用

1．7 本课题的研究意义与研究内容

1．7．1 研究意义

1．7．2 研究内容

第二章 紫薯花青素提取工艺研究

2．1 试验材料与设备

2．1．1 试验原料

2．1．2 试验试剂

2．1．3 试验设备

2．2 试验方法

2．2．1 标准曲线的绘制

2．2．2 样品中花青素得率的计算

2．2．3 原料的预处理

2．2．4 紫薯花青素提取的单因素试验

2．2．5 响应面优化提取条件

2．2．6 统计分析

2．3 试验结果与分析

2．3．1 标准曲线的绘制

2．3．2 紫薯花青素提取的单因素试验结果

2．3．3 紫薯花青素提取的优化试验结果

2．4 本章小结

第三章 紫薯花青素单体的制备及结构鉴定

3．1 试验材料与设备

3．1．1 试验材料与试剂

3．1．2 试验设备

3．2 试验方法

3．2．1 紫薯花青素的初步纯化

3．2．2 紫薯花青素单体的制备和结构鉴定

3．2．3 统计分析

3．3 试验结果与分析

3．3．1 大孔树脂的筛选

3．3．2 X-5大孔树脂最大上样量的测定结果

3．3．3 上样液pH对吸附效果的影响

3．3．4 上样流速对吸附效果的影响

3．3．5 乙醇浓度对解吸效果的影响

3．3．6 洗脱速度对解吸效果的影响

3．3．7 花青素纯度的测定

3．3．8 HPLC分析

3．3．9 PHPLC制备紫薯花青素色谱图

3．3．10 12种花青素单体的纯度检测

3．3．11 12种花青素单体的结构鉴定

3．4 本章小结

第四章 紫薯花青素的体外抗氧化活性研究

4．1 试验材料与设备

4．1．1 试验试剂

4．1．2 试验设备

4．2 试验方法

4．2．1 清除DPPH自由基(DPPH·)能力测定

4．2．2 清除羟基自由基(·OH)能力测定

4．2．3 清除超氧阴离子自由基(O2-·)能力测定

4．2．4 总还原力的测定

4．2．5 金属螯合能力的测定

4．3 统计分析

4．4 试验结果与分析

4．4．1 清除DPPH自由基(DPPH·)能力

4．4．2 清除羟基自由基(·OH)能力

4．4．3 清除超氧阴离子自由基(O2-·)能力

4．4．4 总还原力

4．4．5 对金属的螯合能力

4．5 本章小结

第五章 紫薯花青素对肠道益生菌的增值作用及对有害菌的抑制作用研究

5．1 试验材料与设备

5．1．1 试验菌株

5．1．2 培养基

5．1．3 试验设备

5．2 试验方法

5．2．1 紫薯花青素对肠道益生菌的增殖作用

5．2．2 紫薯花青素对有害菌的抑制作用

5．4 试验结果与分析

5．4．1 紫薯花青素对肠道益生菌的增殖作用

5．4．2 紫薯花青素对有害菌的抑制作用

5．5 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

攻读硕士期间的研究成果