火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道黏膜损伤的保护作用研究

摘要

火麻仁为桑科植物大麻(Cannabis sativa L.)的种仁，有着悠久的药用历史。本研究以本实验室从火麻仁中提取的水溶性多糖(Hemp seed polysaccharide，HSP)为研究对象，结合环磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)诱导小鼠肠道黏膜损伤模型的体内实验和双氧水诱导肠上皮细胞IPEC-1损伤模型的体外实验，探明火麻仁多糖对肠道黏膜损伤的保护作用及可能的作用机理，为开发以火麻仁多糖为功效因子的保健食品、改善药物所致肠道黏膜损伤提供理论依据。　　目的:(1)探讨火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道黏膜氧化损伤的保护作用(2)探讨火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道免疫抑制的保护作用(3)探讨火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道黏膜结构损伤的保护作用及相关机制(4)探讨火麻仁多糖对H2O2诱导IPEC-1细胞氧化损伤的保护作用　　方法:(1)通过连续四天腹腔注射环磷酰胺建立小鼠肠道黏膜损伤的动物模型，通过检测如下指标:小鼠体重及脏器指数、胸腺、脾脏组织形态变化、空肠组织形态和超显微结构、杯状细胞的分布与数量、肠道通透性、小肠灌洗液sIgA含量、血清、肝脏和回肠组织匀浆液中抗氧化因子和细胞因子水平、回肠组织中相关抗氧化因子和细胞因子mRNA表达、回肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1和黏蛋白mucin-2mRNA表达水平和Nrf2-Keap1通路和NF-κB通路上蛋白表达水平。　　(2)通过以H2O2为氧化应激源建立肠上皮细胞IPEC-1体外氧化应激损伤模型。采用MTT法检测HSP对IPEC-1细胞增殖能力，酶标法测IPEC-1细胞的相关抗氧化酶活力水平、RT-qPCR法测相关抗氧化酶mRNA表达，Western blot检测Nrf2-Keap1通路上蛋白表达水平。　　结论:(1)提前灌胃火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道黏膜氧化损伤的具有一定的保护作用，其作用机制可能与Nrf2-Keap1信号通路的激活有关。(2)提前灌胃火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠免疫抑制的具有一定的免疫调节作用，其作用机制可能与NF-κB通路的激活有关。(3)提前灌胃火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道黏膜损伤有一定保护作用，可能与紧密连接蛋白和黏蛋白的表达量上调有关。(4)前期给予HSP0.2对H2O2诱导IPEC-1细胞氧化损伤具有预防保护作用，其作用机制可能与Keap1/Nrf2信号传导途径的激活有关。

目录

声明

摘要

第一章引言

1．1环磷酰胺

1．2肠道黏膜系统

1．2．1肠道黏膜屏障

1．2．2肠道黏膜损伤与氧化应激

1．2．3肠道黏膜损伤与免疫调节

1．2．4肠道黏膜屏障的研究进展

1．3火麻仁的生物活性研究进展

1．3．1对胃肠道作用

1．3．2抗氧化作用

1．3．3免疫调节和抗炎作用

1．3．4其他作用

本课题研究背景和意义

第二章火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道黏膜氧化损伤的保护作用

2．1材料与试剂

2．1．1材料

2．1．2主要试剂

2．1．3实验动物

2．2主要仪器

2．3实验方法

2．3．1实验分组及给药

2．3．2体重及脏器指数测定

2．3．3小鼠血清中抗氧化因子水平检测

2．3．4小鼠肝脏、回肠组织匀浆液中抗氧化因子水平测定

2．3．5小鼠回肠组织的相关抗氧化因子mRNA表达水平测定

2．3．6小鼠回肠组织Nrf2-Keap1通路的相关蛋白表达水平测定

2．3．7数据统计分析

2．4实验结果

2．4．1火麻仁多糖对小鼠体重和脏器指数的影响

2．4．2火麻仁多糖对小鼠血清的抗氧化水平的影响

2．4．3火麻仁多糖对小鼠肝脏组织匀浆液的抗氧化水平的影响

2．4．4火麻仁多糖对小鼠回肠组织匀浆液的抗氧化水平的影响

2．4．5火麻仁多糖对小鼠回肠组织的相关抗氧化基因表达水平的影响

2．4．6火麻仁多糖对小鼠回肠组织Nrf2-Keap1通路的相关蛋白表达水平影响

2．5讨论

2．6本章小结

第三章火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道免疫抑制的保护作用

3．1材料与试剂

3．1．1材料

3．1．2主要试剂

3．1．3实验动物

3．2主要仪器

3．3．1实验分组及给药

3．3．2小鼠胸腺、脾脏组织形态学观察

3．3．3小鼠血清中细胞因子水平检测

3．3．4小鼠肝脏、回肠组织匀浆液细胞因子含量测定

3．3．5回肠灌洗液中sIgA含量测定

3．3．6小鼠回肠组织的相关细胞因子mRNA表达水平测定

3．3．7小鼠回肠组织NF-κB通路的相关蛋白表达水平测定

3．3．7数据统计分析

3．4实验结果

3．4．1火麻仁多糖对小鼠胸腺、脾脏组织形态的影响

3．4．2火麻仁多糖对小鼠血清中细胞因子含量的影响

3．4．3火麻仁多糖对小鼠肝脏组织匀浆液中细胞因子含量的影响

3．4．4火麻仁多糖对小鼠回肠组织匀浆液中细胞因子含量的影响

3．3．5火麻仁多糖对回肠灌洗液中sIgA含量的影响

3．4．6火麻仁多糖对小鼠回肠组织中细胞因子mRNA表达水平的影响

3．4．7火麻仁多糖对小鼠回肠组织NF-κB通路的相关蛋白表达水平的影响

3．5讨论

3．6本章小结

第四章火麻仁多糖对环磷酰胺致小鼠肠道黏膜结构损伤的保护作用及相关机制探讨

4．1材料与试剂

4．1．1材料

4．1．2主要试剂

4．1．3实验动物

4．2主要仪器

4．3实验方法

4．3．1实验分组及给药

4．3．2小鼠空肠组织形态学观察

4．3．3小鼠空肠超显微结构观察

4．3．4小鼠肠道杯状细胞的分布及数量的变化

4．3．5小鼠肠道通透性测定

4．3．6小鼠回肠组织紧密连接蛋白mRNA表达水平测定

4．3．7火麻仁多糖对小鼠肠道黏蛋白mRNA表达水平的影响

4．3．9数据统计分析

4．4实验结果

4．4．1火麻仁多糖对小鼠空肠组织形态学的影响

4．4．2火麻仁多糖对小鼠空肠绒毛长度、隐窝深度的影响

4．4．3火麻仁多糖对小鼠空肠超显微结构的影响

4．4．4火麻仁多糖对小鼠肠道杯状细胞的分布及数量的影响

4．4．5火麻仁多糖对小鼠肠道通透性的影响

4．4．6火麻仁多糖对小鼠回肠紧密连接蛋白mRNA表达水平的影响

4．4．7火麻仁多糖对小鼠肠道黏蛋白mRNA表达水平的影响

4．5讨论

4．6本章小结

第五章火麻仁多糖对H2O2诱导IPEC-1细胞氧化损伤的保护作用

5．1材料与试剂

5．1．1材料

5．1．2主要试剂

5．2主要仪器

5．3实验方法

5．3．1细胞培养

5．3．2建立氧化应激损伤模型

5．3．7 Nrf2-Keap1通路的相关蛋白表达水平测定

5．3．8数据统计分析

5．4实验结果

5．4．2火麻仁多糖对IPEC-1细胞存活率的影响

5．4．4IPEC-1细胞抗氧化酶活力水平的测定

5．4．5火麻仁多糖对IPEC-1细胞抗氧化基因mRNA表达水平的影响

5．4．6火麻仁多糖对IPEC-1细胞中Nrf2／Keap1信号通路下游基因表达水平的影响

5．4．7火麻仁多糖对Nrf2-Keap1通路的相关蛋白表达水平的影响

5．5讨论

5．6本章小结

第六章结语与展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果